Charles Mayo wurde am 19. Juli 1865 in Rochester, Minnesota, als Sohn von William Worrall Mayo geboren, einem gebürtigen Engländer und Allgemeinmediziner, der sich 1855 im Territorium von Minnesota niedergelassen hatte.
Der Junge begleitete seinen Vater und seinen älteren Bruder, William J. Mayo, auf unzähligen Fahrten im Dorf und auf dem Land, wenn der Vater zu seinen Patienten reiste. Bei mehreren Gelegenheiten verabreichte er den Patienten Äther, bevor er sein Diplom in Medizin erworben hatte.
Charles Mayo studierte in den öffentlichen Schulen von Rochester und erhielt 1888 den Grad eines Doktors der Medizin von der Northwestern University. Als Mayo etwa ein Jahr zu Hause war und seinem Vater und seinem älteren Bruder in ihrer Praxis für Allgemeinmedizin assistierte, gründeten die Schwestern von St. Francis das St. Mary’s Hospital in Rochester. Charles war einer von dreien im Personal des neuen Krankenhauses, die anderen beiden waren sein Vater und sein älterer Bruder. In späteren Jahren erinnerte sich der ältere Bruder: „Charlie trieb mich bald dazu an, ein besserer Chirurg zu werden, und ich begann, mich auf abdominale Arbeiten und auf Operationen an den Harnleitern und Nieren zu spezialisieren.“ Er konnte eine schwierige Situation mit außergewöhnlicher Schnelligkeit meistern, und er besaß die Fähigkeit, eine Vielzahl anspruchsvoller chirurgischer Probleme zu bewältigen, so dass er bald so unterschiedliche Eingriffe wie die Exzision eines Kniegelenks, die Durchtrennung des Ganglion gasserianum und die Hysterektomie durchführen konnte. Er erwarb auch ein hohes Maß an Geschick bei Operationen am Auge, am Kopf und am Hals, während sich sein Bruder auf Bauchoperationen konzentrierte.
Er widmete sich der sehr umfangreichen Praxis, die er und sein Bruder gemeinsam betrieben, nachdem sich ihr Vater um 1890 aus der aktiven Praxis zurückgezogen hatte. Die beiden Brüder zogen 1892 einen dritten Arzt hinzu, 1901 einen weiteren und viele andere, als die von ihrem Vater 1863 gegründete Praxis im südlichen Minnesota und dann im ganzen Staat bekannt wurde.
Bis 1903 war der Name Mayo Clinic nicht nur denjenigen bekannt, die die Dienste der Brüder und ihrer Mitarbeiter in Anspruch nahmen, sondern auch anderen Ärzten außerhalb der kleinen Gruppe von Ärzten in Rochester. 1915 gründeten Charles und sein Bruder die Mayo Foundation for Medical Education and Research (Mayo-Stiftung für medizinische Ausbildung und Forschung) als Teil der Graduiertenschule der Universität von Minnesota, mit Stipendien in verschiedenen Fachbereichen. Die Mayos wurden berühmte Lehrer und wurden von den Hunderten junger Chirurgen, die mit ihnen arbeiteten, mit tiefer Zuneigung und Respekt betrachtet.
Dieser klassische Aufsatz gibt einen faszinierenden Überblick über den Stand der Dickdarm- und Enddarmchirurgie um die Jahrhundertwende. Darin schlägt Mayo die Zweckmäßigkeit des synchronen kombinierten Zugangs vor, „wenn der Chirurg einen guten Assistenten hat.“ Es wird angenommen, dass er der erste war, der dieses Manöver empfahl.
Ehrungen aller Art wurden Charles Mayo, wie auch seinem älteren Bruder, zuteil. Er wurde zum Präsidenten der Western Surgical Association, der Society of Clinical Surgery, des Clinical Congress of Surgeons of North America, der American Medical Association, des American College of Surgeons und der American Surgical Association gewählt.
Er starb am 26. Mai 1939 im Alter von 73 Jahren in Chicago, wo er sich bei einem Besuch eine Penumonie zugezogen hatte. Der Tod seines Bruders folgte zwei Monate später.