Nachfolgende epidemiologische Studien legten nahe, dass EMS mit bestimmten Chargen von L-Tryptophan in Verbindung steht, die von einem einzigen großen japanischen Hersteller, Showa Denko, geliefert wurden. Es wurde schließlich klar, dass neuere Chargen von Showa Denko’s L-Tryptophan mit Spurenverunreinigungen kontaminiert waren, die dann für den EMS-Ausbruch von 1989 verantwortlich gemacht wurden. Das L-Tryptophan wurde von einem Bakterium produziert, das in offenen Behältern in einer Düngemittelfabrik von Showa Denko gezüchtet wurde. Während insgesamt 63 Spurenverunreinigungen schließlich identifiziert wurden, konnten nur sechs von ihnen mit EMS in Verbindung gebracht werden. Die Verbindung EBT (1,1′-Ethyliden-bis-L-Tryptophan, auch bekannt als „Peak E“) war die einzige Verunreinigung, die durch die anfängliche Analyse identifiziert werden konnte, aber weitere Analysen ergaben PAA (3-(Phenylamino)-L-Alanin, auch bekannt als „UV-5″) und Peak 200 (2-L-Tryptophan). Zwei der verbleibenden uncharakterisierten Peaks, die mit EMS assoziiert waren, wurden später als 3a-Hydroxy-1,2,3,3a,8,8a-Hexahydropyrroloindol-2-carbonsäure (Peak C) und 2-(2-Hydroxyindolin)-Tryptophan (Peak FF) bestimmt. Diese wurden mittels massgenauer LC-MS, LC-MS/MS und mehrstufiger Massenspektrometrie (MSn) charakterisiert. Die letzte der sechs Verunreinigungen (Peak AAA/“UV-28“, als „die am stärksten mit EMS assoziierte Verunreinigung“ wurde als zwei verwandte Kettenisomere charakterisiert; Peak AAA1 ((S)-2-amino-3-(2-((S,E)-7-methylnon-1-en-1-yl)-1H-indol-3-yl)propansäure, ein Kondensationsprodukt zwischen L-Tryptophan und 7-Methylnonansäure) und Peak AAA2 ((S)-2-Amino-3-(2-((E)-dec-1-en-1-yl)-1H-indol-3-yl)propansäure, ein Kondensat zwischen L-Tryptophan und Decansäure). Es wurde nie ein konsistenter Zusammenhang zwischen einer oder mehreren spezifischen Spurenverunreinigungen, die in diesen Chargen identifiziert wurden, und den Auswirkungen von EMS hergestellt. Während insbesondere EBT häufig als Verursacher angeführt wurde, gibt es keinen statistisch signifikanten Zusammenhang zwischen EBT-Gehalten und EMS. Von den 63 Spurenverunreinigungen zeigten nur die beiden AAA-Verbindungen einen statistisch signifikanten Zusammenhang mit Fällen von EMS (mit einem p-Wert von 0,0014).
Da sich die meisten Untersuchungen auf Versuche konzentrierten, einzelne Verunreinigungen mit EMS in Verbindung zu bringen, gibt es einen vergleichsweise großen Mangel an detaillierten Untersuchungen zu anderen möglichen kausalen oder beitragenden Faktoren. Tryptophan selbst wurde als ein potentiell wichtiger beitragender Faktor bei EMS in Betracht gezogen. Während Kritiker dieser Theorie argumentiert haben, dass diese Hypothese nicht in der Lage ist, die nahezu fehlenden Berichte über EMS vor und nach dem EMS-Ausbruch zu erklären, berücksichtigt dies nicht den plötzlichen, schnellen Anstieg der Verwendung von Tryptophan unmittelbar vor dem Ausbruch von 1989 und ignoriert den starken Einfluss des Vermächtnisses des EMS-Ausbruchs und des erweiterten FDA-Verbots der späteren Verwendung von Tryptophan. Entscheidend ist, dass dies auch die Existenz einer Reihe von Fällen von EMS ignoriert, die sich sowohl vor als auch nach der primären Epidemie entwickelten, einschließlich mindestens eines Falles, in dem das Tryptophan getestet wurde und sich herausstellte, dass es nicht die Verunreinigungen enthielt, die in den kontaminierten Chargen des Tryptophans von Showa Denko gefunden wurden, sowie Fälle, in denen andere Nahrungsergänzungsmittel EMS auslösten, und sogar ein Fall von EMS, der durch eine übermäßige Aufnahme von L-Tryptophan durch den übermäßigen Verzehr von Cashewnüssen ausgelöst wurde. Eine große kanadische Analyse fand eine Reihe von Patienten, die die CDC-Kriterien für EMS erfüllten, aber nie Tryptophan ausgesetzt waren, was „kausale Interpretationen früherer Studien in Frage stellt“. Andere Studien haben zahlreiche große Fehler in vielen der epidemiologischen Studien über die Assoziation von Tryptophan mit EMS aufgezeigt, die ernsthafte Zweifel an der Gültigkeit ihrer Ergebnisse aufkommen lassen. Die FDA kam zu dem Schluss, dass „andere Marken von L-Tryptophan oder L-Tryptophan selbst, unabhängig von der Menge oder dem Vorhandensein von Verunreinigungen, nicht als kausal oder beitragend zur Entwicklung von EMS ausgeschlossen werden konnten“. Sogar Tierstudien haben nahegelegt, dass Tryptophan selbst, wenn es von empfänglichen Personen entweder allein oder in Kombination mit einer anderen Komponente im Produkt aufgenommen wird, zu den pathologischen Merkmalen bei EMS führt“.
Zum Zeitpunkt des Ausbruchs hatte Showa Denko kürzlich Änderungen an seinen Herstellungsverfahren vorgenommen, von denen man annahm, dass sie mit der möglichen Herkunft der Verunreinigungen, die in den betroffenen Tryptophan-Chargen nachgewiesen wurden, in Verbindung stehen. Eine wesentliche Änderung war die Reduzierung der Menge an Aktivkohle, die zur Reinigung jeder Charge verwendet wurde, von >20 kg auf 10 kg. Ein Teil der verunreinigten Chargen hatte auch einen weiteren Filtrationsschritt umgangen, bei dem bestimmte Verunreinigungen durch Umkehrosmose entfernt wurden. Außerdem handelte es sich bei der zur Synthese von Tryptophan verwendeten Bakterienkultur um einen Stamm von Bacillus amyloliquefaciens, der gentechnisch so verändert worden war, dass er die Tryptophan-Produktion erhöhte. Obwohl die vorherigen vier Generationen des gentechnisch veränderten Stammes ohne Zwischenfälle verwendet worden waren, wurde die fünfte Generation, die für die verunreinigten Chargen verwendet wurde, als mögliche Quelle für die nachgewiesenen Verunreinigungen angesehen. Dies wurde missbraucht, um zu argumentieren, dass die Gentechnik selbst die Hauptursache für die Verunreinigung war, eine Haltung, die heftig kritisiert wurde, weil sie die anderen bekannten Nicht-GVO-Ursachen für Verunreinigungen übersieht und von Anti-GVO-Aktivisten dazu benutzt wurde, die Entwicklung der Biotechnologie mit falschen Informationen zu bedrohen. Die Reduzierung der verwendeten Aktivkohlemenge und die Einführung des Bacillus amyloliquefaciens-Stammes der fünften Generation wurden beide mit der Entwicklung von EMS in Verbindung gebracht, aber aufgrund der starken Überlappung dieser Änderungen konnte der genaue unabhängige Beitrag jeder Änderung nicht bestimmt werden (obwohl festgestellt wurde, dass die Umgehung der Umkehrosmosefiltration für bestimmte Chargen nicht signifikant mit den kontaminierten Tryptophanchargen in Verbindung steht). Während Showa Denko eine Reinheit von 99,6 % behauptete, wurde angemerkt, dass „die Mengen der bekannten EMS-assoziierten Verunreinigungen, EBT und PAA, bemerkenswert gering waren, in der Größenordnung von 0,01 %, und leicht dem Nachweis entgehen konnten“.
Regulatorische Reaktion
Die FDA lockerte ihre Beschränkungen für den Verkauf und die Vermarktung von Tryptophan im Februar 2001, beschränkte aber weiterhin den Import von Tryptophan, das nicht für eine ausgenommene Verwendung bestimmt war, bis 2005.