Cabrillo schiffte als junger Mann nach Havanna und schloss sich mit Hernán Cortés in Mexiko (damals Neuspanien genannt) zusammen. Später machte ihn sein Erfolg beim Goldabbau in Guatemala zu einem der reichsten der Conquistadores in Mexiko. Laut seinem Biographen Harry Kelsey nahm er sich eine indigene Frau zur Lebensgefährtin und zeugte mehrere Kinder, darunter mindestens drei Töchter. Später heiratete er Beatriz Sanchez de Ortega in Sevilla während eines Aufenthaltes in Spanien. Sie kehrte mit ihm nach Guatemala zurück und gebar ihm zwei Söhne.
Cabrillo profitierte von dem Encomienda-System, das die indigenen Völker Amerikas versklavte. In Honduras zum Beispiel löste er Familien auf, schickte die Männer in die Minen, um Gold zu suchen, und in den Wald, um Material zu ernten, das er für den Schiffsbau benötigte. Die Frauen und Mädchen übergab er seinen Soldaten und Matrosen, vermutlich als Sklaven.
Er begleitete Francisco de Orozco bei der Unterwerfung des indigenen mixtekischen Volkes an der Stelle, die später zur Stadt Oaxaca in Mexiko werden sollte. Es ist wenig darüber bekannt, was Cabrillo dort tat.
Im Jahr 1539 entdeckte Francisco de Ulloa, der von Cortés beauftragt worden war, den Golf von Kalifornien und erreichte fast bis zum 30. Cabrillo wurde daraufhin vom neuen Vizekönig von Neuspanien, Antonio de Mendoza, beauftragt, eine Expedition die Pazifikküste hinauf zu leiten, auf der Suche nach Handelsmöglichkeiten, vielleicht um einen Weg nach China zu finden (denn die volle Ausdehnung des nördlichen Pazifiks war unbekannt) oder um die mythische Straße von Anián (oder Nordwestpassage) zu finden, die den Pazifik mit der Hudson Bay verbindet. Cabrillo baute und besaß das Flaggschiff seiner Unternehmung (zwei oder drei Schiffe) und profitierte von jedem Handel oder Schatz.
Cabrillo National Monument am Point Loma in San Diego, Kalifornien
Im Jahr 1540 segelte die Flotte von Acajutla, El Salvador, los und erreichte Navidad, Mexiko am Weihnachtstag. In Mexiko kam Pedro de Alvarado der Stadt Nochistlán zu Hilfe, die von feindlichen Eingeborenen belagert wurde, und wurde getötet, als sein Pferd auf ihn fiel und seine Brust zerquetschte. Nach Alvarados Tod nahm der Vizekönig die Flotte Alvarados in Besitz. Ein Teil der Flotte wurde unter dem Kommando von Ruy López de Villalobos zu den Philippinen geschickt, zwei der Schiffe wurden unter dem Kommando von Cabrillo nach Norden geschickt.
Am 27. Juni 1542 brach Cabrillo mit drei Schiffen von Navidad auf: der 200-Tonnen-Galeone und Flaggschiff San Salvador, der kleineren La Victoria (ca. 100 Tonnen) und der spät getakelten, sechsundzwanzig ruderigen „fragata“ oder „bergantin“ San Miguel. Am 1. August ankerte Cabrillo in Sichtweite der Insel Cedros. Noch vor Ende des Monats passierten sie die Baja-Spitze (von de Ulloa 1539 „Cabo del Engaño“ genannt) und kamen in „unerforschte Gewässer, in denen noch kein spanisches Schiff zuvor gewesen war“. Am 28. September landete er in der heutigen San Diego Bay und nannte sie „San Miguel“. Etwas mehr als eine Woche später erreichte er Santa Catalina Island (7. Oktober), die er nach seinem Flaggschiff „San Salvador“ nannte. Als er ein Boot auf die Insel schickte, „erschien eine große Schar bewaffneter Indianer“, mit denen er sich aber später „anfreundete“. Die nahe gelegene Insel San Clemente wurde „Victoria“ genannt, zu Ehren des dritten Schiffes der Flotte. Am nächsten Morgen, dem 8. Oktober, kam Cabrillo in die Bucht von San Pedro, die „Baya de los Fumos“ (englisch: Rauchbucht) genannt wurde. Am nächsten Tag ankerten sie über Nacht in der Santa Monica Bay. Als sie die Küste hinauffuhren, sah Cabrillo die Insel Anacapa, von der sie von den Indianern erfuhren, dass sie unbewohnt war.
Die Flotte verbrachte die nächste Woche auf den Inseln, meist vor Anker in Cuyler Harbor, einer Bucht an der nordöstlichen Küste von San Miguel Island. Am 18. Oktober sah die Expedition Point Conception, den sie „Cabo de Galera“ nannte.
Im Oktober 1542 notierte Cabrillos Expedition die Namen zahlreicher Chumash-Dörfer an der kalifornischen Küste und auf den angrenzenden Inseln – damals in den beiden sich bekriegenden Provinzen Xexo (regiert von einer „alten Frau“, heute Santa Barbara County, Kalifornien) und Xucu (heute Ventura County, Kalifornien) gelegen.
Am 13. November sichteten und benannten sie „Cabo de Piños“ (möglicherweise entweder Point Pinos oder Point Reyes), verpassten aber den Eingang zur San Francisco Bay, ein Fehler, den Seefahrer in den nächsten zwei Jahrhunderten und mehr wiederholen sollten, wahrscheinlich weil der Eingang häufig von Nebel verhüllt ist. Die Expedition könnte bis zum Russian River oder sogar bis zum Columbia vorgedrungen sein, bevor Herbststürme sie zur Umkehr zwangen. Wegen der Ungenauigkeit seiner Beschreibung ist es ungewiss, welchen nördlichen Fluss die Expedition gesichtet hat. Auf dem Rückweg die Küste hinunter fuhr Cabrillo in die Monterey Bay ein und nannte sie „Bahia de Los Piños“.
Am 23. November 1542 kam die kleine Flotte wieder in „San Salvador“ (Santa Catalina Island) an, um zu überwintern und Reparaturen durchzuführen. Dort stieg Cabrillo um den Weihnachtsabend herum aus seinem Boot und zersplitterte sich das Schienbein, als er auf einen zerklüfteten Felsen stolperte, während er versuchte, einige seiner Männer vor angreifenden Tongva-Kriegern zu retten. Die Verletzung infizierte sich und entwickelte Wundbrand, und er starb am 3. Januar 1543 und wurde begraben. Ein möglicher Grabstein wurde später auf San Miguel Island gefunden. Sein Stellvertreter brachte den Rest der Gruppe zurück nach Navidad, wo sie am 14. April 1543 ankamen.
Der offizielle Bericht eines Notars über Cabrillos Expedition ging verloren; alles, was überlebt hat, ist eine Zusammenfassung, die von einem anderen Forscher, Andrés de Urdaneta, angefertigt wurde, der auch Zugang zu Schiffslogbüchern und Karten hatte. Vor dem Bericht des Historikers Antonio de Herrera Anfang des 17. Jahrhunderts erschien kein gedruckter Bericht über Cabrillos Reise.