Hochdurchsatz-Fortschritte für die chronologische Lebensspanne und neue Aufmerksamkeit für ruhende Zellen
CLS in S. cerevisiae und S. pombe verwendet ähnliche Assays, um zu bestimmen, wie lange Zellen in flüssiger Kultur überleben können, nachdem die Glukose und verschiedene andere Nährstoffe aufgebraucht sind (Longo et al, 2012; Chen und Runge, 2009, 2012; Fabrizio und Longo, 2003; Zuin et al., 2008, 2010). Da Zellen durch Verhungern arretieren, spielen Nährstoffsensierung und Abbau interner Proteinkomponenten durch Autophagie wichtige Rollen bei CLS (Sideri et al., 2014; Yamaguchi und Otsu, 2012; Alvers et al., 2009a,b; Aris et al., 2012, 2013). Beim Design von CLS-Assays müssen einige wichtige Punkte beachtet werden. Erstens, wenn der CLS-Assay als Modell für andere Organismen dienen soll, dann sollte der Assay die gleichen Auswirkungen auf Hefe haben, wie der analoge Assay auf andere Modelle. Für die meisten Organismen gehört dazu die Verlängerung der Lebensspanne durch kalorische Restriktion, und diese langlebigen Zellen sind häufig resistent gegen Stress (z. B. Fabrizio et al., 2001). Während die Bedingungen für S. cerevisiae schon vor langer Zeit etabliert wurden, rekapituliert das primäre synthetische Medium, das im Bereich von S. pombe verwendet wird, das sogenannte Edinburgh Minimal Medium (EMM oder EMM2), diese konservierten Eigenschaften der Lebensspanne und der kalorischen Restriktion nicht (Chen und Runge, 2009). Stattdessen benötigt S. pombe entweder ein reichhaltiges YES-Medium (Hefeextrakt (YE) und Supplemente (S) und Kohlenstoffquelle) oder ein Medium namens SD (ein synthetisches, chemisch abgeleitetes Medium (S) plus Dextrose (D)) mit einem anderen Gehalt an Komponenten als EMM (Chen und Runge, 2009; Zuin et al., 2010). Zweitens sollte der Assay Informationen über den Modellorganismus einbeziehen. S. cerevisiae und S. pombe können schnell ganze Populationen aus einer einzigen Zelle wachsen lassen, was bei Menschen oder Mäusen nicht möglich ist. Daher regulieren Hefen ihre Kernmechanismen möglicherweise anders, wenn die meisten Zellen in der Kultur absterben (z. B. von ∼108 auf 10 Zellen/ml), als wenn die Zellzahl auf 1 % des ursprünglichen Niveaus fällt (von ∼108 auf 106 Zellen/ml). Tatsächlich verhalten sich S. cerevisiae in einem CLS-Assay auf komplexe Weise, denn wenn die Zellen auf ∼0,1 % der ursprünglichen Dichte lebender Zellen pro ml fallen, beginnt ein Teil der Zellen zu wachsen (Fabrizio et al., 2004) (Abb. 30.2B). Die Zellen vergiften sich auch selbst, indem sie kleine organische Säuren (z. B. Essigsäure) in das Medium absondern (Burtner et al., 2009). Dieses komplexe Verhalten führt dazu, dass die meisten S. cerevisiae CLS-Assays nicht über einen Verlust der Lebensfähigkeit von unter 1% hinausgehen. Im Gegensatz dazu kann der S. pombe CLS-Assay einen Abfall der Lebensfähigkeit um 5-6 Größenordnungen zeigen, ohne dass es zu einem Nachwachsen kommt, was eine einfachere Isolierung von langlebigen Zellen ermöglicht (Chen und Runge, 2009; Chen et al., 2013).
Sowohl S. cerevisiae als auch S. pombe wurden verwendet, um ihre jeweiligen genomweiten Deletionsstämme auf Mutanten mit erweiterter CLS zu screenen. Jede Gendeletion ist mit einer einzigartigen DNA-Sequenz oder einem Barcode markiert. Diese CLS-Assays beinhalteten das Überleben in Mikrotiterplatten (Powers et al., 2006) oder den Standard-Assay, bei dem die mit den Deletionen assoziierten Barcodes verwendet wurden, um die mit unterschiedlichen Lebensspannen assoziierten Mutanten zu identifizieren. Die Barcode-Häufigkeiten wurden mittels Microarray-Hybridisierung (Wei et al., 2008) oder Barcode-Sequenzierungsansätzen (Chen et al., 2013; Sideri et al., 2014) bestimmt. Zusätzliche Gene, die CLS bei Überexpression verlängern, wurden ebenfalls identifiziert (Ohtsuka et al., 2009; Miwa et al., 2011). Während die Liste der Gene, die die Lebensspanne regulieren, hier nicht wiedergegeben werden soll, ist es wichtig zu erwähnen, dass sich TOR als ein wichtiger Regulator der Lebensspanne in beiden Hefen herausgestellt hat (Powers et al., 2006; Wei et al., 2008; Sideri et al., 2014). Im Allgemeinen haben die Standard-CLS-Assays viele Informationen geliefert, die die Bedeutung einer Reihe von evolutionär konservierten Signalwegen hervorheben, die die Alterung kontrollieren (Longo et al., 2012).
Die Ergebnisse der CLS-Assays geben einige Rätsel auf. Warum sind S. cerevisiae am Ende von CLS so variabel? Warum haben S. pombe eine so kurze CLS (14 Tage)? Während die Antworten auf diese Fragen nicht bekannt sind, besteht eine Möglichkeit darin, dass die Assays nicht beachtete evolutionäre Merkmale in beiden Spezies übersehen. Ein solches Merkmal, das normalerweise nicht berücksichtigt wird, ist ein anderer differenzierter Zustand der Hefe, der in CLS-Assays auftritt, die ruhende G0-Zelle oder Q-Zelle.
Wenn S. cerevisiae bis zur Sättigung wächst und in der Kultur verbleibt, differenziert sich ein Teil der Zellen in kleine, dichte Zellen, die vom Rest der Population isoliert werden können (Allen et al., 2006) (Abb. 30.2D). Neuere Studien haben gezeigt, dass Q-Zellen durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung zur Analyse von den anderen Zellen wegsortiert werden können (Miles und Breeden, 2017). Diese Zellen haben bemerkenswerte Eigenschaften in Bezug auf CLS. Sie können fast 1 Jahr im Wasser überleben, sind sehr stressresistent und treten synchron wieder in den Zellzyklus ein, wenn ihnen Nährstoffe zugeführt werden (Allen et al., 2006; Miles und Breeden, 2017). Die Tatsache, dass sie sich einige Tage nach Beginn einer CLS bilden, deutet darauf hin, dass sie wahrscheinlich eine Rolle bei der Analyse von CLS-Zellen spielen. Ob die inzwischen anerkannte Anwesenheit von Q-Zellen in den S. cerevisiae CLS-Assays einen Unterschied zu den bisherigen Schlussfolgerungen aus ihnen macht, ist derzeit unklar. Das Breeden-Labor hat S. cerevisiae Q-Zellen in den letzten Jahren intensiv analysiert, und es konnte gezeigt werden, dass transkriptionelle Repressoren und Chromatin-Remodeler (z. B. Xbp1 und Rpd3) eine Schlüsselrolle in diesem Prozess spielen (Miles und Breeden, 2017; Miles et al., 2013; McKnight et al., 2015). Proteine, von denen bekannt ist, dass sie Rollen beim G1/S-Übergang des Zellzyklus spielen, haben auch Rollen beim Übergang zur Ruhephase (z. B. der SBF-Transkriptionskomplex), und diese Kernkomplexe werden durch den Erwerb anderer Faktoren (z. B. Msa1 und Msa2) an die Ruhephaseninduktion angepasst (Miles et al., 2016). Durch die Nutzung von Informationen aus zyklischen Zellen wird also die zentrale zelluläre Maschinerie, die den Eintritt in G0 steuert, aufgeklärt. Da die Identifizierung solcher Kernmaschinerien ein wichtiges Ziel der Alternsforschung ist, stellt diese Arbeit einen wichtigen Schritt nach vorne dar. Eine wichtige Aufgabe für die Zukunft wird es sein, herauszufinden, welche anderen zellulären Prozesse diese konservierten Bahnen kontrollieren.
Die Quieszenz in S. pombe ist etwas anders. Wenn S. pombe im Labor gepaart wird, werden zwei Zellen entgegengesetzter Paarungstypen zusammen auf ein Medium gesetzt, dem reduzierter Stickstoff fehlt (-N-Medium). Der Mangel an Stickstoff induziert ein Signal, das das Paarungsprogramm startet und zur Sporulation führt, um haploide Sporen zu produzieren. Wenn jedoch kein Paarungspartner vorhanden ist, gehen die Zellen langsam in einen G0-Zustand über, der durch die stäbchenförmige S. pombe gekennzeichnet ist, und werden zu kleinen, runden Zellen. Diese Zellen können monatelang überleben und wieder in den Zellzyklus eintreten, wenn dem Medium wieder Stickstoff zugeführt wird, und sind somit Q-Zellen für diese Art (Su et al., 1996; Yanagida, 2009). Wichtig ist, dass diese Q-Zellen nicht in Kulturen beobachtet werden, die aufgrund der Erschöpfung ihrer Glukosevorräte aufhören zu wachsen (Übersicht in Yanagida, 2009). Da die Erschöpfung der Glukose die Ursache für den Stillstand während der S. pombe CLS ist (Abb. 30.2E), ist es unwahrscheinlich, dass die kleinen runden Q-Zellen in diesen Assays eine wichtige Rolle spielen.
Eine beträchtliche Menge an Transkriptomanalysen und Charakterisierungen wurde durchgeführt, um zu bestimmen, welche Gene für die Bildung von S. pombe Q-Zellen erforderlich sind. Das Ergebnis war die Identifizierung von Genen für Proteine, die in fast jedem zellulären Kompartiment wirken (Yanagida, 2009; Shimanuki et al., 2007). Eine große Herausforderung besteht darin, herauszufinden, wie diese vielen Akteure koordiniert werden, um die Etablierung, Aufrechterhaltung und den Abbau des Q-Zell-Zustands zu steuern, im Grunde das Gegenteil der Situation in S. cerevisiae, wo Teile der Kernmaschinerie bekannt sind. Zukünftige Arbeiten werden zeigen, wie gut die Informationen aus diesen beiden Hefen helfen können, unsere Lücken im Verständnis des Q-Zell-Zustandes zu füllen und ob fundamentale Unterschiede bestehen, wie sie bei der replikativen Alterung zu sehen sind.