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The Novel Approach to Tissue Regeneration
Einer der entscheidendsten Momente auf dem Gebiet des Tissue Engineering ereignete sich 1954 in der Stadt Boston in einem Projekt unter der Leitung von Dr. Joseph Murray. Unter seiner Leitung führte ein Team von Ärzten erfolgreich die erste Transplantation eines soliden Organs durch. In diesem Fall wurde eine Niere von einem eineiigen Zwilling an seinen schwerkranken Bruder transplantiert. Dieses Ereignis löste eine weit verbreitete Forschungsbewegung aus, in der Wissenschaftler und Labore umfangreiche Arbeiten auf den Gebieten der Transplantationsbiologie, der Immunologie und anderer verwandter Disziplinen begannen. Mit diesen Forschungsanstrengungen gingen bedeutende Fortschritte in der Entwicklung chirurgischer Techniken und in den Versuchen, die Unterdrückung des Wirtsimmunsystems zu verbessern, einher. Doch auch Jahrzehnte später liegen noch viele Herausforderungen zwischen Gewebetransplantation und klinischem Erfolg. Einige dieser Herausforderungen sind die mit dem eigentlichen Transplantationsverfahren verbundenen Kosten, die notwendige arbeitsintensive Pflege und die hohe Wahrscheinlichkeit einer Wirtsabstoßung. Das Hauptproblem liegt auch heute noch in der grundsätzlichen Frage des Organ- und Spendermangels (1).
Bis in die 1980er Jahre konzentrierte sich die Mehrheit der Forschungslabore auf die Bekämpfung des „Immunproblems“, um die Organtransplantationstechnologie zu verbessern, und es wurden Entwicklungen mit Xenografts und biohybriden Trägern durchgeführt. Erst Mitte der 1980er Jahre, als sich Dr. Joseph Vacanti vom Kinderkrankenhaus in Boston mit Dr. Robert Langer von der Abteilung für Polymerwissenschaften des MIT zusammentat, wurde die Idee, funktionelle Gewebe für die Transplantation zu entwickeln, zu einer potenziellen Lösung für das Problem der Organknappheit. Ihre gemeinsame Arbeit sollte das Gebiet des Tissue Engineering neu definieren (1).
Die „Vision“
Das Konzept
Vacanti und Langer schwebte die Entwicklung eines Systems vor, das in der Lage ist, neuen und natürlichen permanenten Gewebeersatz zu erzeugen, indem es synthetische, biologisch abbaubare 3D-Matrizen verwendet, die mit Parenchymzellen besiedelt sind. Konzeptionell enthielt diese Idee viele der Antworten auf die aktuellen Probleme, die mit dem Gewebeersatz verbunden sind. Im Idealfall könnte das Polymerscaffold so gestaltet werden, dass es die Zellproliferation und -differenzierung fördert, das Einwachsen von Gefäßen ermöglicht, kontrolliert abgebaut werden kann und in vivo vollständig resorbiert wird, so dass nur das neu gebildete Gewebe übrig bleibt. Im Erfolgsfall könnte die Entwicklung und Implementierung dieses Geräts mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Methoden bieten, da das Gerüst potenziell so manipuliert werden könnte, dass eine erhöhte Kontrolle über die Freisetzung von Hormonen und Wachstumsfaktoren möglich ist, die für die Zellfunktionalität wichtig sind, die Anheftung der Zellen an die Matrix vor dem Einbringen in den Körper die Anzahl der implantierbaren Zellen erhöhen könnte, die Form in verschiedene Formen strukturiert werden könnte und diese Methode autologe oder allogene Transplantationen ermöglichen könnte (1).
Vorläufige Daten und Belege
Die Gebrüder Vacanti und Langer stützten sich bei ihren Forschungsbemühungen auf mehrere grundlegende Beobachtungen, die in Vorstudien gesammelt wurden. Erstens durchlaufen alle Organismen ständig die Prozesse der Erneuerung, des Umbaus und des Ersatzes ihrer Zellen. Zweitens sind Zellen, die von ihrer natürlichen Umgebung losgelöst sind, in der Lage, Strukturen neu zu bilden, wenn sie von ihrer Umgebung ein entsprechendes Signal dazu erhalten. Drittens sind Organparenchymzellen mit der Zellmatrix verankerungsabhängig und spielen eine wesentliche Rolle bei Zellform, -teilung und -differenzierung. Außerdem hatten frühere Studien gezeigt, dass 2-3mm3 das größte Volumen an Gewebe ist, das implantiert werden kann, das eine adäquate Ernährung, Gasaustausch usw. ermöglicht, bis eine Angiogenese stattfindet. Mit diesen biologischen Beobachtungen im Hinterkopf machten sich die Gebrüder Vacanti und Langer daran, ein neuartiges 3D-Polymergerüst zu entwickeln, das mit paranchymalen Organzellen in Kultur beladen und dann in einen Wirt implantiert werden kann (1).
Die ideale Matrix
Eine der zentralen Überlegungen beim Design dieses Polymergerüsts für das Engineering von Ersatzgeweben betrifft die Auswahl eines geeigneten Matrixmaterials. Dieses ideale Gerüstmaterial müsste mehrere wesentliche Eigenschaften und Abstimmungsmöglichkeiten für eine ordnungsgemäße Funktionalität in dieser Anwendung haben, denn es muss biokompatibel, mechanisch stabil, flexibel, kontrolliert abbaubar, resorbierbar und in der Lage sein, spezifische chemische Wechselwirkungen mit den ausgesäten Zellen einzugehen. In Bezug auf die Biokompatibilität ist es wichtig, dass das Polymer keine unerwünschte Immunreaktion im Wirt auslöst, die letztlich zu einer Immunabstoßung und einem Versagen des Verfahrens führen könnte. Physikalisch gesehen muss die Matrix ein gewisses Maß an mechanischer Stabilität und Flexibilität aufweisen, um sicherzustellen, dass sie den notwendigen Halt und Raum für die Gewebebildung bieten kann, so dass sie leicht in variablen Formen und Strukturen gestaltet und konstruiert werden kann, und sie muss in der Lage sein, dem Verfahren und der In-vivo-Umgebung zu widerstehen, um diese Struktur nach der Implantation zu erhalten. Schließlich würden einige wünschenswerte Tuning-Fähigkeiten des idealen Polymergerüsts abstimmbare Degradationseigenschaften beinhalten, die Matrix sollte in der Lage sein, vom Körper resorbiert zu werden, während nur natürliches, funktionelles Gewebe zurückbleibt, und die Manipulation der Oberflächenchemie, um die gewünschten Interaktionen zwischen den ausgesäten Zellen und der Matrixoberfläche zu diktieren (1).
Die Gebrüder Vacanti und Langer stellten fest, dass Polymere aus der Gruppe der Polyester und den Familien der Polymilchsäuren, Polyglykolsäuren und deren Copolymere der beste Kandidat für ihr Gerüstmaterial waren. Diese Polymere waren nicht nur biokompatibel, stabil und flexibel, sondern konnten auch durch Hydrolyse zu Kohlendioxid- und Wasserprodukten abgebaut werden und die Resorptionsrate des Polymers konnte je nach Verhältnis der verwendeten Polymermonomere auf einer Zeitskala von Monaten bis Jahren variiert werden (1).
Schritte zur Realität
Die Jahre nach der Vacanti-Langer-Paarung im Jahr 1985 waren geprägt von rasanten Experimenten und Entwicklungen auf dem Gebiet des Tissue Engineering, um die Machbarkeit des angedachten Gerüsts für die Geweberegeneration zu klären.
Eines der ersten durchgeführten Experimente verwendete eine kleine Scheibe aus Polyanhydrid, auf der Hepatozyten in einer Monolage ausgesät und dem Tier implantiert wurden (siehe Abbildung 3). Die Analyse ergab, dass die Zellzahl und -dichte für ein erfolgreiches Engraftment nicht ausreichend waren (1). Dieses Experiment führte jedoch zu der Erkenntnis einer grundlegenden Einschränkung. Alle Zellen benötigen einen adäquaten Austausch von Sauerstoff und Nährstoffen mit der Umgebung und den Abtransport von Abfallprodukten. Da der Stoffaustausch nur an der extrazellulären Oberfläche stattfindet, ist dies für eine einzelne Schicht von Zellen relativ einfach zu erreichen. Mit zunehmender Zellmasse vergrößert sich die Oberfläche für den Austausch – und damit auch die Masse der Zellen, die diesen Austausch benötigen. Bei der Entwicklung von Gerüstformen müssen diese Überlegungen also berücksichtigt werden, um eine adäquate Nährstoffaufnahme und ein Überleben zu ermöglichen (2). Wie Joseph Vacanti dieses Problem so eloquent beschrieben hat, „…könnte man genauso gut versuchen, eine Zimmerpflanze in einem Basketball wachsen zu lassen (3).“ Auf der Suche nach einer Antwort auf dieses grundlegende Problem kam Vacanti nach eigenen Angaben die Idee, als er während eines Familienurlaubs an der Küste von Cape Cod Seetang beobachtete. Unter der Haut des Seetangs befindet sich ein verzweigtes Netzwerk aus hohlen Ästen, die die Anforderungen an das Oberflächenvolumen im Verhältnis zur Fläche erfüllen und den Organismus mit frischem Sauerstoff versorgen, während sie Abfallprodukte ausscheiden. Dieses Seetang-Design eines verzweigten Netzwerks inspirierte die Verwendung von viel luftigeren, „wattebauschartigen“ Polymeren in zukünftigen Experimenten (2).
Einige Jahre später, im Jahr 1991, gelang unter der Leitung von Dr. Charles Vacanti an der University of Massachusetts Medical School (1) ein weiterer großer experimenteller Durchbruch. Der Gruppe gelang es, mit Hilfe von synthetischen, biologisch abbaubaren und mit Chondrozyten beladenen Schablonen homogene Knorpelplatten mit einem Gewicht von jeweils bis zu 100 mg zu entwickeln. Diese Scaffolds wurden dann unter die Haut von athymischen Mäusen implantiert und analysiert. Der neu gebildete Knorpel behielt nach der Resorption des Polymers die relative Form und die Abmessungen der ursprünglichen Schablonen bei. Zusätzlich wurden Lakunen in Proben beobachtet, die nach 81 Tagen geerntet wurden, nicht aber in solchen, die nach 49 Tagen oder früher geerntet wurden. Diese Befunde deuten darauf hin, dass das Gewebe vom Metall zum adulten Knorpel gereift ist. Zur weiteren Unterstützung dieser Schlussfolgerung wurde Typ-III-Kollagen, das für unreifen hyalinen Knorpel von Säugetieren charakteristisch ist, in den jüngeren Proben beobachtet, während Typ-II-Kollagen, das für reifen Knorpel von Säugetieren charakteristisch ist, in Proben beobachtet wurde, die länger als 49 Tage implantiert wurden (1).Der nächste praktische Schritt auf dem Weg zur Entwicklung des angedachten Gerüsts beinhaltete das Engineering von Knorpel in bestimmten, vorher festgelegten Formen und Gestalten. Dies wurde von Puelacher et al. 1993 durchgeführt, als sie Modelle von menschlichem Nasenknorpel unter Verwendung von PGA-Vlies entwickelt haben, die mit einer 5%igen Lösung von Polymilchsäure verklebt wurden. Diese Polymerformen wurden mit einer Suspension von Chrondrozyten besiedelt, die aus neugeborenem bovinen hyalinen Knorpel gewonnen wurden. Diese Konstrukte wurden dann für 8 Wochen in athymische Mäuse implantiert. Die Analyse ergab, dass die Größe und Form der Implantate nach der Resorption des Polymers erhalten blieb und ein relativ elastisches Gewebe zurückblieb, das in der Lage war, seine ursprüngliche Bestätigung nach der Biegung wiederherzustellen (1).
Das klassische Mausexperiment
Das Ziel
Die totale Ohrrekonstruktion ist eine große Herausforderung für plastische Chirurgen aufgrund der komplexen Struktur des Ohres und der begrenzten Regenerationsfähigkeit des Gewebes (2). Es wäre jedoch von großem klinischen Nutzen, eine verbesserte Regenerationsmethode zu haben, da Säuglinge täglich mit unterentwickelten Ohren geboren werden und andere diese Organe bei traumatischen Erlebnissen verlieren (1). Derzeit gibt es zwei Hauptalternativen für die vollständige Rekonstruktion des äußeren Ohres: alloplastische Implantate und autogene Knorpeltransplantate. Alloplastische Implantate werden typischerweise aus Silikon oder Polypropylen in vorgefertigten Formen hergestellt. Ein Vorteil dieser Methode ist, dass die Materialien relativ unbegrenzt verfügbar sind und keine zusätzliche Arbeit oder Zeit für die Formgebung erforderlich ist, da sie vorgeformt geliefert werden. Allerdings sind diese Materialien sehr anfällig für Infektionen und weisen keine lange Haltbarkeit auf. Auf der anderen Seite hat die Verwendung von autogenem Gewebe eine bessere Langzeithaltbarkeit, aber es gibt einen Kompromiss, denn es ist viel Zeit erforderlich, um das Gerüst zu formen, und es gibt oft einen unzureichenden Vorrat an verwendbarem Knorpel (4).
In den 1990er Jahren gelang es Vacanti und Langer, ein Ohr auf dem Rücken einer athymischen Maus zu züchten, dem sie den Spitznamen Auriculosaurus gaben (3) (siehe Abbildung_).
Die Wissenschaft dahinter
Konstruktion des Gerüstes
Um die eigentliche Form und die Abmessungen des Gerüstes zu konstruieren, wurde das Ohr eines 3-jährigen Kindes mit Alginat als Abdruckmaterial abgeformt. Von dem Alginatabdruck wurde dann ein Gipsabdruck erstellt und als Form für die Konstruktion der synthetischen biologisch abbaubaren Polymerkonstrukte verwendet. Das verwendete Polymer bestand aus Polyglykolsäurefasern in einem Vliesstoffnetz mit einer Dicke von ca. 100 um und einem Durchmesser von ca. 15 um. Die Mesh-Fasern wurden dann beim Eintauchen in eine 1%ige Lösung von Polymilchsäure für 2 Sekunden verklebt. Nach diesem Prozess wurde das Polymer mit Hilfe der Gipsform in die Form des Ohres gebracht und die Geräte wurden in 35-mm-Polystyrol-Gewebekulturschalen platziert (4).
Isolation von Chondrozyten
Nach Cao et al. wurden die Chondrozyten aus „frisch geschlachteten“ Kalbsvorderhufen nach Erhalt vom örtlichen Schlachthof gewonnen. Die Zellen wurden aus den Gelenkoberflächen der Gelenke entnommen und einem Kollagenase-Verdau, einer Zentrifugation, einer Filtration und verschiedenen Pufferungsbedingungen als Vorbereitung für den Seeding-Prozess unterzogen (4).
Besiedlung der Polymere und Implantation in athymische Mäuse
Um die Polymere mit den dissoziierten bovinen Zellen zu besäen, wurden 3mL Aliquots der Chondrozytensuspension, bestehend aus 1,5×10^8 Zellen, auf die Polymere gegeben und für 4 Stunden bei 37 Grad Celsius inkubiert, um die Anheftung an die Fasern zu fördern (siehe Abbildung_). Das Kulturmedium wurde mit 10 % fetalem Cald-Serum, 5 ug/mL Ascorbinsäure, 292 ug/mL L-Glutamin, 100 U/mL Penicillin und 100 ug/mL Streptomycin angereichert. Die Matrizen wurden bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 1 Woche lang inkubiert und das Kulturmedium wurde alle 48 Stunden ausgetauscht (Papier). Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen zeigen die Anheftung der Chondrozyten an die Matrix vor der Inkubation und zeigen auch das Vorhandensein von extrazellulären Matrizenkomponenten, die von den Zellen sezerniert werden, was ihre jeweilige Fähigkeit, differenzierte Funktionen auszuführen, bestätigt.Nach der Inkubation wurden die Geräte unter sterilen chirurgischen Verfahren und Vollnarkose in 4-6 Wochen alte athymische männliche Mäuse subkutan implantiert (4).
Ergebnisse
Obwohl der experimentelle Aufbau dieser Prozedur konzeptionell einfach war, lieferten die Ergebnisse einen unschätzbaren Einblick in die Idee des Engineering von Gewebe zur Regeneration mittels 3D-Scaffolds. Nach 6 Wochen In-vivo-Inkubation zeigte die Kontrollgruppe keine Spur von Knorpelbildung. Nach Entfernung des Stents behielt die Haut der Mäuse ihr ursprüngliches Aussehen und das Polymer wurde wie erwartet resorbiert. Die signifikantesten Ergebnisse wurden jedoch in Bezug auf die Unterschiede zwischen den Versuchsgruppen I und II beobachtet. Nach 3-4 Wochen In-vivo-Inkubation wurden Unterschiede in der Form des Ohres deutlich. Bei den Mäusen der Versuchsgruppe I war die Morphologie nach 4 Wochen nahezu identisch mit der des Implantats und blieb auch nach der Entfernung des Stents für weitere 8 Wochen erhalten (siehe Abbildung _). Im Gegensatz dazu entwickelten die Mäuse der Versuchsgruppe II ein Ohr, das nur annähernd dem des Polymergerüsts entsprach, da es in der Größe reduziert und in der Form verzogen war, wie in Abbildung _ (4) zu sehen ist.
Die gesellschaftliche Reaktion
Auch wenn dieser Durchbruch für die wissenschaftliche Gemeinschaft und die Pioniere des Tissue Engineering monumental und aufregend war, da er zahlreiche Wege für Untersuchungen eröffnete und wertvolle wissenschaftliche Fragen aufwarf, hatte er eine ebenso starke Reaktion auf die wissenschaftliche Gemeinschaft. Nach der Veröffentlichung von Vacantis Arbeit im August 1997 wurde eine starke oppositionelle Empörung von der Anti-Gentechnik-Gruppe und Tierschützern geäußert. Diese ablehnende gesellschaftliche Reaktion wurde durch einen Film der BBC-Sendung Tomorrow’s World sowie durch eine Anzeige der Gruppe Turning Point Project in der New York Times begünstigt (siehe Abbildung 6).
Die Anzeige zeigte das Bild von Vacantis Maus mit einem irreführenden Haupttext, der besagte: „Dies ist ein tatsächliches Foto einer gentechnisch veränderten Maus mit einem menschlichen Ohr auf ihrem Rücken.“ Diese Aussage implizierte, dass die Wissenschaftler das Genom der Maus durch Einfügen von Segmenten menschlicher DNA verändert hatten. Die starke Reaktion, die von den gesellschaftlichen Gruppen ausgelöst wurde, hält bis heute an, und einige der klassischen Bildunterschriften aus dem Artikel sind im Folgenden aufgeführt, um ein besseres Verständnis dafür zu schaffen, wie die gesellschaftliche Gemeinschaft diese wissenschaftlichen Fortschritte wahrnahm (5):
„Denkt irgendjemand, dass es deshalb schockierend ist, dass diese junge Biotechnologie-Industrie es für in Ordnung hält, den Evolutionsprozess zu kapern und das Leben auf der Erde so umzugestalten, dass es ihren Bilanzen entspricht?“
Bislang gibt es keine halb menschlichen, halb tierischen „Chimären“ (wie Meerjungfrauen oder Zentauren), aber vielleicht haben wir sie bald.“
„Biotech-Firmen entfernen munter Bestandteile des Menschen (und anderer Lebewesen) und behandeln uns alle wie Autoteile auf einer Tauschbörse.“
„Eines Tages, wenn eine dieser Firmen endlich entscheidet, dass die öffentliche Stimmung aufnahmefähig ist, werden sie eine Mensch-Gorilla-Kombination herstellen, um die Schwerarbeit zu erledigen.“
„Haben wir unseren Verstand verloren?“ (5)
(1) Atala, Anthony, und David J. Mooney. Synthetic Biodegradable Polymer Scaffolds. Boston: Birkhäuser, 1997. Print.
(2) Vacanti, Joseph. „Tissue Engineering und Regenerative Medizin“. Vortrag. The Jayne Lecture. Amphilsoc. Web.
(3)D’Agnese, Joseph. „Brothers with Heart.“ Discover July 2001. Discover Magazine. 1 July 2001. Web.
(4)Cao, Yilin, Joseph P. Vacanti, Keith T. Paige, Joseph Upton, and Charles A. Vacanti. „Transplantation von Chondrozyten unter Verwendung eines Polymer-Zell-Konstrukts zur Herstellung von gewebeverstärktem Knorpel in der Form eines menschlichen Ohrs“. Plastic and Reconstructive Surgery 100.2 (1997): 297-302. Print.
(5)Rouse, Roger. „Who Plays God in the 21st Century?“ New York Times 25. Mai 2001, 9. Aufl., S. 62. Print.