Cabrillo a embarqué pour La Havane alors qu’il était un jeune homme et a rejoint les forces d’Hernán Cortés au Mexique (alors appelé Nouvelle-Espagne). Plus tard, son succès dans l’exploitation de mines d’or au Guatemala fit de lui l’un des plus riches des conquistadores au Mexique. Selon son biographe Harry Kelsey, il a pris une femme indigène comme épouse de fait et a engendré plusieurs enfants, dont au moins trois filles. Plus tard, il épousa Beatriz Sanchez de Ortega à Séville lors d’un séjour en Espagne. Elle est retournée au Guatemala avec lui et lui a donné deux fils.
Cabrillo a bénéficié du système de l’encomienda qui réduisait en esclavage les peuples autochtones des Amériques. Au Honduras, par exemple, il a brisé les familles, envoyant les hommes dans les mines pour trouver de l’or et dans la forêt pour récolter les matériaux dont il avait besoin pour la construction de navires. Les femmes et les filles, il les donnait à ses soldats et à ses marins, vraisemblablement comme esclaves.
Il a accompagné Francisco de Orozco pour soumettre les indigènes mixtèques à ce qui allait devenir la ville d’Oaxaca, au Mexique. On sait peu de choses sur ce que Cabrillo a fait là-bas.
En 1539, Francisco de Ulloa, qui avait été mandaté par Cortés, découvre le golfe de Californie et atteint presque aussi loin au nord que le 30e parallèle. Cabrillo est alors chargé par le nouveau vice-roi de Nouvelle-Espagne, Antonio de Mendoza, de mener une expédition le long de la côte pacifique à la recherche d’opportunités commerciales, peut-être pour trouver un chemin vers la Chine (car l’étendue totale du Pacifique nord était inconnue) ou pour trouver le mythique détroit d’Anián (ou passage du Nord-Ouest) reliant l’océan Pacifique à la baie d’Hudson. Cabrillo construisit et posséda le vaisseau amiral de son entreprise (deux ou trois navires), et se tint prêt à profiter de tout commerce ou trésor.
En 1540, la flotte part d’Acajutla, au Salvador, et atteint Navidad, au Mexique, le jour de Noël. Pendant son séjour au Mexique, Pedro de Alvarado se rendit à l’aide de la ville de Nochistlán, assiégée par des indigènes hostiles, et fut tué lorsque son cheval lui tomba dessus, lui écrasant la poitrine. Après la mort d’Alvarado, le vice-roi a pris possession de la flotte d’Alvarado. Une partie de la flotte est envoyée aux îles Philippines sous le commandement de Ruy López de Villalobos et deux des navires sont envoyés vers le nord sous le commandement de Cabrillo.
Le 27 juin 1542, Cabrillo part de Navidad avec trois navires : le galion et navire amiral de 200 tonnes San Salvador, le plus petit La Victoria (environ 100 tonnes), et le San Miguel, un » fragata » ou » bergantin » de vingt-six rames, gréé en lateen. Le 1er août, Cabrillo a jeté l’ancre en vue de l’île Cedros. Avant la fin du mois, ils ont dépassé la pointe Baja (nommée « Cabo del Engaño » par de Ulloa en 1539) et sont entrés dans « des eaux inexplorées, où aucun navire espagnol n’avait été auparavant ». Le 28 septembre, il débarque dans ce qui est aujourd’hui la baie de San Diego et la nomme « San Miguel ». Un peu plus d’une semaine plus tard, il atteint l’île Santa Catalina (7 octobre), qu’il nomme « San Salvador », du nom de son navire amiral. En envoyant un bateau sur l’île, « une grande foule d’Indiens armés est apparue », mais ils se sont ensuite « liés d’amitié ». L’île voisine de San Clemente fut nommée « Victoria », en l’honneur du troisième navire de la flotte. Le lendemain matin, 8 octobre, Cabrillo arriva dans la baie de San Pedro, qui fut nommée « Baya de los Fumos » (en anglais : Smoke Bay). Le lendemain, ils jetèrent l’ancre pour la nuit dans la baie de Santa Monica. En remontant la côte, Cabrillo vit l’île d’Anacapa, dont les Indiens leur apprirent qu’elle était inhabitée.
La flotte passe la semaine suivante dans les îles, principalement ancrée dans Cuyler Harbor, une baie sur la côte nord-est de l’île San Miguel. Le 18 octobre, l’expédition aperçoit Point Conception, qu’elle nomme « Cabo de Galera ».L’expédition de Cabrillo a enregistré en octobre 1542 les noms de nombreux villages Chumash sur la côte californienne et les îles adjacentes – alors situés dans les deux provinces belligérantes de Xexo (dirigée par une « vieille femme », aujourd’hui comté de Santa Barbara, Californie) et Xucu (aujourd’hui comté de Ventura, Californie).
Le 13 novembre, ils ont repéré et nommé « Cabo de Piños » (peut-être Point Pinos ou Point Reyes), mais ont manqué l’entrée de la baie de San Francisco, un oubli que les navigateurs répéteront pendant les deux siècles suivants et plus, très probablement parce que son entrée est fréquemment enveloppée de brouillard. L’expédition a peut-être atteint le nord de la Russian River ou même le Columbia avant que les tempêtes d’automne ne l’obligent à rebrousser chemin. En raison de l’imprécision de sa description, on ne sait pas quelle rivière du nord l’expédition a aperçue. En redescendant la côte, Cabrillo est entré dans la baie de Monterey, la nommant « Bahia de Los Piños ».
Le 23 novembre 1542, la petite flotte est revenue à « San Salvador » (île de Santa Catalina) pour passer l’hiver et effectuer des réparations. Là, vers la veille de Noël, Cabrillo sortit de son bateau et se fendit le tibia en trébuchant sur un rocher déchiqueté alors qu’il tentait de sauver certains de ses hommes de l’attaque des guerriers Tongva. La blessure s’est infectée et a développé une gangrène. Il est mort le 3 janvier 1543 et a été enterré. Une possible pierre tombale a été retrouvée plus tard sur l’île San Miguel. Son second a ramené le reste du groupe à Navidad, où ils sont arrivés le 14 avril 1543.
Le rapport officiel d’un notaire sur l’expédition de Cabrillo a été perdu ; tout ce qui survit est un résumé de celui-ci fait par un autre enquêteur, Andrés de Urdaneta, qui avait également accès aux journaux et aux cartes des navires. Aucun récit imprimé du voyage de Cabrillo n’est apparu avant celui de l’historien Antonio de Herrera au début du XVIIe siècle.