Des avancées à haut débit pour la durée de vie chronologique et une nouvelle attention pour les cellules quiescentes
La SCL chez S. cerevisiae et S. pombe utilise des essais similaires pour déterminer combien de temps les cellules peuvent survivre en culture liquide après l’épuisement du glucose et de divers autres nutriments (Longo et al, 2012 ; Chen et Runge, 2009, 2012 ; Fabrizio et Longo, 2003 ; Zuin et al., 2008, 2010). Comme les cellules s’arrêtent par inanition, la détection des nutriments et la dégradation des composants protéiques internes par autophagie jouent un rôle important dans le CLS (Sideri et al., 2014 ; Yamaguchi et Otsu, 2012 ; Alvers et al., 2009a,b ; Aris et al., 2012, 2013). La conception des essais CLS nécessite de garder à l’esprit certains points essentiels. Premièrement, si le test CLS doit servir de modèle pour d’autres organismes, il doit avoir les mêmes effets sur la levure que le test analogue sur d’autres modèles. Pour la plupart des organismes, ces caractéristiques comprennent l’allongement de la durée de vie par restriction calorique, et ces cellules à longue durée de vie sont souvent résistantes au stress (p. ex., Fabrizio et al., 2001). Bien que ces conditions aient été établies pour S. cerevisiae il y a longtemps, le milieu synthétique primaire utilisé dans le domaine de S. pombe, appelé milieu minimal d’Édimbourg (EMM ou EMM2), ne récapitule pas ces caractéristiques conservées de durée de vie et de restriction calorique (Chen et Runge, 2009). Au lieu de cela, S. pombe a besoin soit d’un milieu riche YES (extrait de levure (YE) et suppléments (S) et source de carbone), soit d’un milieu appelé SD (un milieu synthétique dérivé chimiquement (S) plus dextrose (D)) avec des niveaux de composants différents de ceux de l’EMM (Chen et Runge, 2009 ; Zuin et al., 2010). Deuxièmement, le test doit intégrer des informations sur l’organisme modèle. S. cerevisiae et S. pombe peuvent faire croître rapidement des populations entières à partir d’une seule cellule, ce qui n’est pas possible chez l’homme ou la souris. Les levures peuvent donc réguler leurs machineries centrales différemment lorsque la plupart des cellules de la culture meurent (par exemple, en passant de ∼108 à 10 cellules/mL) et lorsque le nombre de cellules tombe à 1 % du niveau initial (de ∼108 à 106 cellules/mL). En fait, les S. cerevisiae se comportent de manière complexe dans un test CLS, car lorsque les cellules tombent à ∼0,1 % de la densité initiale de cellules vivantes par ml dans un test CLS, une fraction des cellules commence à repousser (Fabrizio et al., 2004) (Fig. 30.2B). Les cellules s’empoisonnent également en sécrétant de petits acides organiques (par exemple, de l’acide acétique) dans le milieu (Burtner et al., 2009). En raison de ce comportement complexe, la plupart des tests CLS de S. cerevisiae ne dépassent guère une perte de viabilité inférieure à 1 %. En revanche, le test CLS de S. pombe peut montrer une chute de viabilité de 5 à 6 ordres de grandeur sans repousse, ce qui permet d’isoler plus facilement les cellules à longue durée de vie (Chen et Runge, 2009 ; Chen et al., 2013).
La S. cerevisiae et la S. pombe ont toutes deux été utilisées pour cribler leurs ensembles respectifs de souches de délétion à l’échelle du génome pour les mutants à CLS étendu. Chaque délétion de gène est marquée par une séquence d’ADN unique ou un code-barres. Ces essais CLS ont inclus la survie dans des plaques de microtitration (Powers et al., 2006) ou l’essai standard utilisant les codes-barres associés aux délétions pour identifier les mutants associés à différentes durées de vie. Les fréquences des codes-barres ont été déterminées à l’aide d’une hybridation de microréseaux (Wei et al., 2008) ou d’approches de séquençage de codes-barres (Chen et al., 2013 ; Sideri et al., 2014). Des gènes supplémentaires qui étendent le CLS lors de la surexpression ont également été identifiés (Ohtsuka et al., 2009 ; Miwa et al., 2011). Bien que la liste des gènes qui régulent la durée de vie ne sera pas examinée ici, il est important de noter que TOR est apparu comme un important régulateur de la durée de vie chez les deux levures (Powers et al., 2006 ; Wei et al., 2008 ; Sideri et al., 2014). En général, les essais CLS standard ont permis d’obtenir de nombreuses informations qui soulignent l’importance d’un ensemble de voies conservées au cours de l’évolution qui contrôlent le vieillissement (Longo et al., 2012).
Les résultats des essais CLS présentent quelques énigmes. Pourquoi les S. cerevisiae sont-ils si variables à la fin du CLS ? Pourquoi les S. pombe ont-ils un CLS si court (14 jours) ? Bien que les réponses à ces questions ne soient pas connues, il est possible que les tests ne tiennent pas compte de caractéristiques évolutives non appréciées chez les deux espèces. Une de ces caractéristiques qui n’est généralement pas prise en compte est un autre état différencié de la levure qui se produit dans les essais CLS, la cellule G0 quiescente ou cellule Q.
Lorsque S. cerevisiae croît jusqu’à saturation et reste en culture, une fraction de cellules se différencie en petites cellules denses qui peuvent être isolées à l’écart du reste de la population (Allen et al., 2006) (Fig. 30.2D). Des études plus récentes ont montré que les cellules Q peuvent être triées à l’écart des autres cellules par tri cellulaire activé par fluorescence pour être analysées (Miles et Breeden, 2017). Ces cellules ont des propriétés remarquables en termes de CLS. Elles peuvent survivre pendant près d’un an dans l’eau, sont très résistantes au stress et réintègrent de manière synchrone le cycle cellulaire lorsque des nutriments leur sont ajoutés (Allen et al., 2006 ; Miles et Breeden, 2017). Le fait qu’elles se forment quelques jours après le début d’un CLS indique qu’elles jouent probablement un rôle dans l’analyse des cellules CLS. On ne sait pas encore si la présence désormais appréciée des cellules Q dans les analyses CLS de S. cerevisiae fait une différence par rapport aux conclusions précédentes qui en ont été tirées. Le laboratoire Breeden a analysé intensément les cellules Q de S. cerevisiae ces dernières années, et il a été démontré que les répresseurs de transcription et les remodeleurs de chromatine (par exemple, Xbp1 et Rpd3) jouent des rôles clés dans ce processus (Miles et Breeden, 2017 ; Miles et al., 2013 ; McKnight et al., 2015). Les protéines connues pour leur rôle dans la transition G1/S du cycle cellulaire jouent également un rôle dans la transition vers la quiescence (par exemple, le complexe de transcription SBF), et ces complexes centraux sont adaptés à l’induction de la quiescence par l’acquisition d’autres facteurs (par exemple, Msa1 et Msa2) (Miles et al., 2016). Ainsi, en tirant parti des informations provenant des cellules en cycle, la machinerie cellulaire centrale qui régit l’entrée en G0 est en cours d’élucidation. L’identification de ces mécanismes centraux étant un objectif majeur de la recherche sur le vieillissement, ce travail représente une avancée importante. Un effort futur important nécessitera de déterminer quels autres processus cellulaires ces voies conservées contrôlent.
La quiescence chez S. pombe est quelque peu différente. Lorsque les S. pombe sont accouplés en laboratoire, deux cellules de types d’accouplement opposés sont placées ensemble sur un milieu qui manque d’azote réduit (milieu -N). L’absence d’azote induit un signal qui lance le programme d’accouplement et conduit à la sporulation pour produire des spores haploïdes. Cependant, en l’absence d’un partenaire d’accouplement, les cellules entrent lentement dans un état G0 caractérisé par la forme de bâtonnet de S. pombe, devenant de petites cellules rondes. Ces cellules peuvent survivre pendant des mois et entrer à nouveau dans le cycle cellulaire lorsque l’azote est réintroduit dans le milieu ; ce sont donc des cellules Q pour cette espèce (Su et al., 1996 ; Yanagida, 2009). Il est important de noter que ces cellules Q ne sont pas observées dans les cultures qui cessent de croître après avoir épuisé leurs réserves de glucose (voir Yanagida, 2009). Comme l’épuisement du glucose est ce qui provoque l’arrêt pendant le CLS de S. pombe (Fig. 30.2E) ; les petites cellules Q rondes semblent peu susceptibles de jouer un rôle majeur dans ces essais.
Une quantité substantielle d’analyse et de caractérisation du transcriptome a été réalisée pour déterminer quels gènes sont nécessaires à la fabrication des cellules Q de S. pombe. Le résultat a été l’identification de gènes pour des protéines qui agissent dans presque tous les compartiments cellulaires (Yanagida, 2009 ; Shimanuki et al., 2007). Un défi majeur consiste à déterminer comment ces nombreux acteurs sont coordonnés pour régir l’établissement, le maintien et le désassemblage de l’état de la cellule Q, en fait l’inverse de la situation chez S. cerevisiae, où des parties de la machinerie centrale sont connues. Les travaux futurs détermineront dans quelle mesure les informations provenant de ces deux levures peuvent aider à combler nos lacunes dans la compréhension de l’état de cellule Q et si des différences fondamentales existent, comme on le voit dans le vieillissement réplicatif.