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La nouvelle approche de la régénération tissulaire
L’un des moments les plus critiques dans le domaine de l’ingénierie tissulaire s’est produit dans la ville de Boston en 1954 dans le cadre d’un projet dirigé par le Dr Joseph Murray. Sous son contrôle, une équipe de médecins a réalisé avec succès la première transplantation d’un organe solide. En l’occurrence, un rein a été transplanté d’un vrai jumeau à son frère gravement malade. Cet événement a stimulé un vaste mouvement de recherche au cours duquel des scientifiques et des laboratoires ont entrepris des travaux approfondis dans les domaines de la biologie des transplantations, de l’immunologie et d’autres disciplines connexes. Ces travaux de recherche se sont accompagnés d’avancées significatives dans le développement des techniques chirurgicales et dans les tentatives d’améliorer la suppression immunitaire de l’hôte. Cependant, même des décennies plus tard, de nombreux défis subsistent entre les greffes de tissus et le succès clinique. Certains de ces défis incluent les dépenses associées à la procédure de transplantation proprement dite, les soins nécessaires à forte intensité de main-d’œuvre et la forte possibilité de rejet par l’hôte. Encore aujourd’hui, le problème principal réside dans la question fondamentale de la pénurie d’organes et de donneurs (1).
La majorité des laboratoires de recherche jusqu’aux années 1980 concentraient leur attention sur les moyens de combattre le « problème immunitaire » pour améliorer la technologie de transplantation d’organes et les développements utilisaient des xénogreffes et des dispositifs de support biohybride. Ce n’est qu’au milieu des années 1980, lorsque Joseph Vacanti, MD, de l’hôpital pour enfants de Boston, s’est associé au Dr Robert Langer, du département des sciences des polymères du MIT, que l’idée de concevoir des tissus fonctionnels destinés à la transplantation est devenue une solution potentielle pour combattre le problème de la pénurie d’organes. Ensemble, leurs travaux allaient venir redéfinir le domaine de l’ingénierie tissulaire (1).
La « vision »
Le concept
Vacanti et Langer ont envisagé le développement d’un système capable de générer des remplacements de tissus permanents nouveaux et naturels en utilisant des matrices synthétiques biodégradables 3D ensemencées de cellules parenchymateuses. Sur le plan conceptuel, cette idée apportait de nombreuses réponses aux problèmes actuels liés au remplacement des tissus. Idéalement, l’échafaudage polymère pourrait être conçu pour favoriser la prolifération et la différenciation des cellules, permettre la croissance vasculaire, être dégradé de manière contrôlée et se résorber complètement in vivo en ne laissant que le tissu nouvellement formé. En cas de succès, le développement et la mise en œuvre de ce dispositif pourraient offrir plusieurs avantages par rapport aux méthodes traditionnelles, car l’échafaudage pourrait potentiellement être manipulé pour permettre un contrôle accru de la libération d’hormones et de facteurs de croissance essentiels à la fonctionnalité des cellules, la fixation des cellules à la matrice avant leur introduction dans le corps pourrait augmenter le nombre de cellules pouvant être implantées, le moule pourrait être structuré en différentes formes, et cette méthode pourrait permettre des transplantations autologues ou allogéniques (1).
Données préliminaires et preuves à l’appui
Dans la poursuite de leurs efforts de recherche, les frères Vacanti et Langer ont basé leurs travaux sur plusieurs observations fondamentales qui ont été recueillies lors d’études préliminaires. Tout d’abord, tous les organismes connaissent continuellement des processus de renouvellement, de remodelage et de remplacement de leurs cellules. Deuxièmement, les cellules qui sont dissociées de leur environnement naturel sont capables de reformer des structures lorsque le milieu environnant le leur signale de manière appropriée. Troisièmement, les cellules parenchymateuses des organes sont dépendantes de l’ancrage avec la matrice cellulaire et jouent des rôles essentiels dans la forme, la division et la différenciation des cellules. En outre, des études antérieures ont démontré que 2 à 3 mm3 est le plus grand volume de tissu pouvant être implanté et permettant une nutrition adéquate, des échanges gazeux, etc. jusqu’à ce que l’angiogenèse se produise. Forts de ces observations biologiques, les frères Vacanti et Langer ont entrepris de concevoir un nouvel échafaudage polymère 3D qui pourrait être chargé de cellules d’organes paranchymaux en culture, puis implanté dans un hôte (1).
La matrice idéale
L’une des considérations centrales dans la conception de cet échafaudage polymère pour l’ingénierie des tissus de remplacement concerne la sélection d’un matériau de matrice approprié. Ce matériau d’échafaudage idéal devrait avoir plusieurs caractéristiques essentielles et des capacités de réglage pour une bonne fonctionnalité dans cette application. Il doit être biocompatible, mécaniquement stable, flexible, dégradable de manière contrôlable, résorbable et capable de faire des interactions chimiques spécifiques avec les cellules ensemencées. En termes de biocompatibilité, il est essentiel que le polymère évite de déclencher une réponse immunitaire indésirable chez l’hôte, ce qui pourrait entraîner un rejet immunitaire et l’échec de la procédure. Sur le plan physique, la matrice doit présenter un certain degré de stabilité mécanique et de flexibilité afin de garantir qu’elle puisse fournir le support et l’espace nécessaires à la formation des tissus, de sorte qu’elle puisse être facilement conçue et construite selon des formes et des structures variables, et elle doit pouvoir résister à la procédure et à l’environnement in vivo afin de conserver cette structure après l’implantation. Enfin, certaines capacités de réglage souhaitables de l’échafaudage polymère idéal impliqueraient des caractéristiques de dégradation accordables, la matrice devrait être capable de se résorber dans le corps en ne laissant que des tissus naturels et fonctionnels, et la manipulation de la chimie de surface pour dicter les interactions souhaitées entre les cellules ensemencées et la surface de la matrice (1).
Les frères Vacanti et Langer ont déterminé que les polymères du groupe des polyesters et des familles des acides polylactiques, des acides polyglycoliques et de leurs copolymères étaient les meilleurs candidats pour leur matériau d’échafaudage. Ces polymères étaient non seulement biocompatibles, stables et flexibles, mais ils pouvaient également être dégradés par hydrolyse en produits de dioxyde de carbone et d’eau et la vitesse de résorption du polymère pouvait être conçue pour varier sur une échelle de temps de quelques mois à quelques années en fonction du rapport des monomères du polymère utilisé (1).
Des étapes vers la réalité
Les années qui ont suivi l’appariement Vacanti-Langer en 1985 ont été caractérisées par des expériences et des développements rapides dans le domaine de l’ingénierie tissulaire afin d’élucider la faisabilité du dispositif d’échafaudage envisagé pour la régénération tissulaire.
L’une des premières expériences réalisées a utilisé un petit disque de polyanhydride dans lequel des hépatocytes ont été ensemencés en monocouche sur la plaquette et implantés dans l’animal (voir figure 3). L’analyse a révélé que le nombre et la densité des cellules n’étaient pas suffisants pour une greffe réussie (1). Cependant, cette expérience a permis de prendre conscience d’une contrainte fondamentale. Toutes les cellules nécessitent un échange adéquat d’oxygène et de nutriments avec l’environnement et l’élimination des déchets. Comme le transfert de masse ne se produit qu’à la surface extracellulaire, il est relativement facile d’y parvenir pour une seule couche de cellules. Plus la masse cellulaire augmente, plus la surface d’échange augmente, tout comme la masse des cellules nécessitant cet échange. Ainsi, lors du développement des formes d’échafaudages, ces considérations doivent être prises en compte pour permettre une acquisition nutritionnelle et une survie adéquates (2). Comme Joseph Vacanti l’a si bien décrit, « … vous pourriez aussi bien essayer de faire pousser une plante d’intérieur dans un ballon de basket-ball (3) ». Dans sa quête d’une réponse à cette question fondamentale, Vacanti affirme que l’idée lui est venue alors qu’il observait des algues sur le rivage de Cape Cod pendant des vacances en famille. Sous la peau de l’algue se trouve un réseau ramifié de branches creuses qui répondent aux exigences du rapport surface/volume et fournissent de l’oxygène frais à l’organisme tout en rejetant les sous-produits des déchets. Cette conception d’algue d’un réseau ramifié a inspiré l’utilisation de polymères beaucoup plus aérés, » semblables à des boules de coton « , dans des expériences futures (2).
Plusieurs années plus tard, en 1991, une autre percée expérimentale majeure s’est produite sous la direction du Dr Charles Vacanti à la faculté de médecine de l’Université du Massachusetts (1). Le groupe a réussi à développer des plaques homogènes de cartilage pesant chacune jusqu’à 100 mg en utilisant des modèles synthétiques biodégradables chargés de chondrocytes. Ces échafaudages ont ensuite été implantés sous la peau de souris athymiques et analysés. Le cartilage nouvellement formé a conservé la forme et les dimensions relatives des modèles d’origine lors de la résorption du polymère. De plus, des lacunes ont été observées dans les spécimens prélevés à 81 jours et non dans ceux prélevés à 49 jours ou avant. Ces résultats suggèrent que le tissu est passé du métal au cartilage adulte. Pour étayer cette conclusion, le collagène de type III, qui est caractéristique du cartilage hyalin immature des mammifères, a été observé dans les échantillons les plus jeunes, tandis que le collagène de type II, qui est caractéristique du cartilage mature des mammifères, a été observé dans les spécimens implantés depuis plus de 49 jours (1).L’étape pratique suivante en vue du développement de l’échafaudage envisagé impliquait l’ingénierie du cartilage dans des formes spécifiques prédéterminées. C’est ce qu’ont fait Puelacher et al. en 1993 en développant des modèles de cartilage nasal humain à l’aide d’une maille non tissée de PGA liée à une solution d’acide polylactique à 5%. Ces formes polymères ont été ensemencées avec une suspension de chrondrocytes obtenus à partir de cartilage hyalin de bovin nouveau-né. Ces constructions ont ensuite été implantées chez des souris athymiques pendant 8 semaines. L’analyse a révélé que la taille et la forme des implants étaient maintenues lors de la résorption du polymère, laissant derrière lui un tissu relativement résilient capable de rétablir sa confirmation initiale après une flexion (1).
L’expérience classique sur les souris
L’objectif
La reconstruction totale de l’oreille est une question très difficile pour les chirurgiens plastiques en raison de la structure complexe de l’oreille et le tissu a une capacité limitée à se régénérer (2). Cependant, il y aurait de sérieux avantages cliniques à disposer d’une méthode de régénération améliorée car des enfants naissent quotidiennement avec des oreilles sous-développées et d’autres perdent ces organes lors d’expériences traumatiques (1). Il existe actuellement deux grandes alternatives pour la reconstruction totale de l’oreille externe : les implants alloplastiques et les greffes de cartilage autogène. Les implants alloplastiques sont généralement fabriqués en silicone ou en polypropylène dans des formes préfabriquées. L’un des avantages de cette méthode est que les matériaux sont disponibles en quantité relativement illimitée et qu’aucun travail ou temps supplémentaire n’est nécessaire pour façonner le dispositif puisqu’ils sont préformés. Cependant, ces matériaux sont très sensibles aux infections et ne présentent pas une durabilité constante à long terme. D’autre part, l’utilisation de tissus autogènes a une meilleure durabilité à long terme, mais il y a un compromis pour beaucoup de temps est nécessaire pour façonner l’échafaudage et il y a souvent un approvisionnement insuffisant de cartilage utilisable (4).
Dans les années 1990, Vacanti et Langer ont réussi à faire pousser une oreille sur le dos d’une souris athymique qu’ils ont surnommée Auriculosaurus (3) (voir figure_).
La science derrière tout ça
Construction du dispositif
Pour construire la forme et les dimensions réelles du dispositif d’échafaudage, l’oreille d’un enfant de 3 ans a été moulée en utilisant de l’alginate comme matériau d’empreinte. Un moule en plâtre a ensuite été créé à partir de l’empreinte en alginate et utilisé comme moule pour la conception des constructions en polymère synthétique biodégradable. Le polymère utilisé était composé de fibres d’acide polyglycolique dans une maille non tissée d’une épaisseur d’environ 100 um et d’un diamètre d’environ 15 um. Les fibres de la maille ont ensuite été collées par immersion dans une solution d’acide polylactique à 1% pendant 2 secondes. Après ce processus, le polymère a été façonné à la forme de l’oreille à l’aide du moule en plâtre et les dispositifs ont été placés dans des boîtes de culture de tissus en polystyrène de 35 mm (4).
Isolation des chondrocytes
Selon Cao et al, les chondrocytes ont été obtenus à partir de membres antérieurs de veaux » fraîchement abattus » à leur réception de l’abattoir local. Les cellules ont été prélevées sur les surfaces articulaires des articulations et soumises à une digestion à la collagénase, à une centrifugation, à une filtration et à diverses conditions de tamponnement en vue du processus d’ensemencement (4).
Chargement du polymère et implantation dans des souris athymiques
Afin d’ensemencer les polymères avec les cellules bovines dissociées, des aliquotes de 3mL de la suspension de chondrocytes composée de 1,5×10^8 cellules placées sur les polymères et laissées à incuber pendant 4 heures à 37 degrés Celsius pour favoriser l’attachement aux fibres (voir Figure_). Le milieu de culture a été enrichi avec 10% de sérum fœtal de veau, 5 ug/mL d’acide ascorbique, 292 ug/mL de L-glutamine, 100 U/mL de pénicilline et 100 ug/mL de streptomycine. Les matrices ont été incubées à 37 degrés Celsius dans 5% de CO2 pendant 1 semaine et le milieu de culture a été remplacé toutes les 48 heures (papier). Les images au microscope électronique à balayage montrent l’attachement des chrondrocytes à la matrice avant l’incubation et montrent également la présence de composants matriques extracellulaires sécrétés par les cellules, ce qui confirme leur capacité respective à remplir des fonctions différenciées.Après incubation, les dispositifs ont été implantés par voie sous-cutanée chez les souris mâles athymiques de 4 à 6 semaines en utilisant des procédures chirurgicales stériles et une anesthésie générale (4).
Résultats
Bien que le montage expérimental de cette procédure ait été conceptuellement simpliste, les résultats ont donné un aperçu inestimable de l’idée d’ingénierie des tissus pour la régénération au moyen d’échafaudages 3D. Après 6 semaines d’incubation in vivo, le groupe témoin ne présentait aucune trace de formation de cartilage. Lors du retrait de l’endoprothèse, la peau des souris a conservé son aspect d’origine et le polymère s’est résorbé comme prévu. Cependant, les résultats les plus significatifs concernaient les différences observées dans les groupes expérimentaux I et II. Après 3 à 4 semaines d’incubation in vivo, des différences dans la forme de l’oreille sont apparues. Les spécimens du groupe expérimental I ont une morphologie presque identique à celle de l’implant qui était bien établie après 4 semaines et qui s’est maintenue pendant les 8 semaines supplémentaires suivant le retrait de l’endoprothèse (voir la figure _). En revanche, les souris du groupe expérimental II ont développé une oreille qui ne correspondait que grossièrement à celle de l’échafaudage en polymère, car sa taille était réduite et sa forme déformée, comme le montre la figure _ (4).
La réponse sociale
Bien que pour la communauté scientifique et les pionniers de l’ingénierie tissulaire, cette percée était monumentale et exaltante ouvrant de nombreuses pistes d’investigation et soulevant des questions scientifiques précieuses, elle a eu une réponse tout aussi forte sur la communauté scientifique. Après la publication de l’article de Vacanti en août 1997, une forte opposition a été exprimée par le groupe anti-génétique et les militants des droits des animaux. Cette réponse sociale défavorable a été facilitée par un film réalisé par l’émission Tomorrow’s World de la BBC, ainsi que, par une publicité qui a été représentée dans le New York Times par le groupe appelé Turning Point Project (voir figure 6).
La publicité présentait l’image de la souris de Vacanti avec un capitaine trompeur qui déclarait : « C’est une photo réelle d’une souris génétiquement modifiée avec une oreille humaine sur son dos. » Cette déclaration impliquait que les scientifiques avaient modifié le génome de la souris en y insérant des segments d’ADN humain. La forte réaction qui a été suscitée par les groupes sociaux persiste encore aujourd’hui et certaines des légendes classiques de l’article sont énumérées ci-dessous pour favoriser une meilleure compréhension de la façon dont la communauté sociale percevait ces avancées scientifiques (5):
« Quelqu’un pense-t-il qu’il est choquant, par conséquent, que cette industrie naissante de la biotechnologie estime qu’il est normal de capturer le processus d’évolution et de remodeler la vie sur terre pour qu’elle convienne à ses bilans ? »
Pour l’instant, il n’existe pas de « chimères » mi-humaines, mi-animales (comme les sirènes ou les centaures) mais nous pourrions bientôt en avoir »
« Les entreprises de biotechnologie retirent allègrement des composants des êtres humains (et d’autres créatures) et nous traitent tous comme des pièces automobiles dans une bourse d’échange. »
« Un jour, lorsqu’une de ces entreprises décidera enfin que l’humeur du public est réceptive, fabriquera-t-elle un combo humain-gorille pour s’occuper des travaux lourds ? »
« Avons-nous perdu la raison » ? (5)
(1) Atala, Anthony, et David J. Mooney. Les échafaudages en polymères synthétiques biodégradables. Boston : Birkhäuser, 1997. Imprimé.
(2) Vacanti, Joseph. « Ingénierie tissulaire et médecine régénérative ». Conférence. The Jayne Lecture. Amphilsoc. Web.
(3)D’Agnese, Joseph. « Des frères de cœur ». Discover juillet 2001. Magazine Discover. 1er juillet 2001. Web.
(4)Cao, Yilin, Joseph P. Vacanti, Keith T. Paige, Joseph Upton, et Charles A. Vacanti. « Transplantation de chondrocytes à l’aide d’une structure cellulaire en polymère pour produire du cartilage tissulaire en forme d’oreille humaine ». Plastic and Reconstructive Surgery 100.2 (1997) : 297-302. Imprimer.
(5)Rouse, Roger. « Qui joue à Dieu au 21e siècle ? » New York Times 25 mai 2001, 9e édition, sec. 62. Imprimer.