On ne saurait trop insister sur l’importance des animaux de laboratoire dans l’enseignement et la recherche. Les études utilisant des modèles animaux présentent des avantages tels que la disponibilité des sujets expérimentaux, la possibilité d’effectuer des tests invasifs, des prélèvements étendus de tissus et la standardisation de la gravité de la maladie et la possibilité de prophylaxie . D’autres avantages sont la manipulation sûre des sujets, l’élimination de l’attrition de l’étude (sauf en cas de mortalité) et les conditions expérimentales contrôlées. Bien que le choix de l’animal dans la recherche biomédicale pour une investigation particulière puisse être controversé et faire l’objet de nombreuses opinions, les animaux expérimentaux couramment utilisés sont les souris, les rats et les lapins. Les petits rongeurs comme les souris et les rats sont plus préférés aux animaux plus grands comme les lapins, les chiens, les chats, les porcs et les singes .
Dans les recherches sur la fonction de reproduction, en particulier celles qui impliquent l’utilisation d’animaux femelles, les souris et les rats sont couramment utilisés, peut-être en raison de leur cycle œstral bien caractérisé et de leur manipulation sûre. La durée courte et précise de l’œstrus chez ces rongeurs les rend également très adaptés. La détermination de la phase œstrale est essentielle pour sélectionner une femelle qui s’accouplera avec un mâle pour obtenir une grossesse programmée ou pour suivre l’œstrus en tant que variable pouvant affecter la recherche. L’évaluation du cycle œstral chez les animaux de laboratoire est une mesure utile de l’intégrité de l’axe hypothalamo-hypophyso-ovarien et du fonctionnement de l’appareil reproducteur féminin. Elle peut également être utilisée pour étudier les effets des médicaments et des produits chimiques sur la fonction de reproduction fréquemment exprimés comme une perturbation de la morphologie, de la cytologie et de l’histologie typiques des organes reproducteurs et une altération de la durée de phases particulières du cycle œstral.
Le cycle œstral
Le cycle œstral fait référence au cycle de reproduction chez les rongeurs. Il est similaire au cycle reproductif humain, communément appelé cycle menstruel (cycles ovarien et utérin). Le cycle œstral comporte quatre phases, à savoir le proestrus, l’œstrus, le métestrus et le diestrus, et dure de 4 à 5 jours (tableau 1). La période de reproduction et le cycle œstral des souris commencent environ le 26e jour après la naissance avec l’ouverture du vagin, soit environ 10 jours avant la cornification vaginale. L’ouverture vaginale médiée par l’apoptose est un caractère secondaire essentiel chez la souris, qui est utilisé comme un prédicteur de la puberté . L’ouverture vaginale est associée à une augmentation de la concentration d’œstradiol. Chez le rat, une ouverture vaginale se produit lors de la première ovulation .
Chez les rats femelles, la puberté est précédée par la libération pulsatile de l’hormone lutéinisante (LH) après la 4e semaine postnatale, à l’âge de 30 jours environ . Cette période est l’anestrus et se produit environ 8 à 9 jours avant le premier proestrus . Suivent ensuite le premier pro-œstrus, l’œstrus, le métœstrus et le diœstrus. Le métœstrus ne se produit qu’en l’absence de conception .
En revanche, chez l’homme, le cycle menstruel comporte trois phases : la phase menstruelle, la phase proliférative (folliculaire) et la phase sécrétoire (lutéale). Ce cycle commence à la puberté. En moyenne, il dure environ 28 jours entre le début d’une période menstruelle et le début de la suivante. Au milieu du cycle, entre les phases proliférative et sécrétoire, se trouve la phase ovulatoire au cours de laquelle l’ovulation se produit suite à une poussée de LH. La phase proliférative est principalement associée à des niveaux élevés d’œstrogènes tandis que la phase sécrétoire est associée à des niveaux élevés de progestérone .
La phase proestrus correspond au stade folliculaire humain, qui est associé à une augmentation des concentrations d’œstradiol en circulation et à une petite poussée de prolactine, cela entraîne une augmentation de la libération de LH et d’hormone folliculo-stimulante (FSH). Le pic de concentration de FSH, associé à une baisse rapide des niveaux d’œstradiol, correspond à l’ovulation et à la phase d’œstrus. Le métœstrus et le diœstrus sont homologues aux stades sécrétoires précoces et tardifs du cycle reproductif humain, respectivement, avec des niveaux élevés de progestérone .
Perspective historique
Le mot « œstrus » a été utilisé pour la première fois par Heape . Il s’agit d’une adaptation latine du mot grec « oistros » qui signifie « saison sexuelle », « mouche du coche », « frénésie », « aiguillon » ou « folie » . Heape a ensuite nommé et défini les phases du cycle œstral des mammifères en proestrus, metestrus, diestrus et anestrus. Le proœstrus est la phase préparatoire à l’entrée en chaleur d’un animal, le métœstrus est une brève période caractérisée par le déclin des fonctions du corps jaune en l’absence de conception, lorsque les activités des organes reproducteurs diminuent progressivement, le diœstrus est une période de repos de courte durée pendant la saison de reproduction, et l’anœstrus est une période sans reproduction pendant laquelle les organes reproducteurs sont quiescents. Les changements comportementaux, ainsi que les changements morphologiques, cytologiques et histologiques dans l’appareil reproducteur, décrivent ces phases.
Au début, les changements macroscopiques dans la vulve (comme le gonflement de la vulve), les sécrétions vaginales (comme le saignement et le mucus) et l’utérus (comme la congestion) ainsi que les changements microscopiques dans l’appareil reproducteur étaient utilisés pour définir les phases du cycle œstral. Cependant, les résultats macroscopiques n’étaient pas fiables chez les petits rongeurs, et l’analyse histologique était et reste une procédure invasive qui ne convient pas à la détermination des phases du cycle œstral chez les animaux vivants. Stockard et Papanicolaou ont ensuite caractérisé les modifications du vagin au cours du cycle œstral par l’histologie et la cytologie, ce qui a permis de contourner les problèmes antérieurs de manque de fiabilité et d’invasivité. Au fil du temps, diverses études ont approuvé l’évaluation de Stockard et Papanicolaou, ce qui a conduit aux définitions actuelles des phases du cycle œstral. Le frottis de Papanicolaou est encore utilisé aujourd’hui pour le dépistage du cancer du col de l’utérus .
Techniques d’évaluation du cycle œstral
Plusieurs études ont proposé diverses méthodes d’évaluation du cycle œstral basées sur les changements dans la physiologie et l’anatomie de l’animal. Ces méthodes comprennent l’évaluation visuelle, la cytologie vaginale, l’examen histologique des organes reproducteurs, l’impédance de la paroi vaginale et la biochimie urinaire .
Évaluation visuelle
La méthode visuelle d’évaluation du cycle œstral est largement acceptable. Elle est non invasive, simple, bon marché, rapide, moins stressante pour les animaux et les chercheurs, et peut être réalisée n’importe où et à n’importe quel moment, à condition que l’éclairage soit adéquat. Cette méthode est aussi précise et fiable que le frottis vaginal. Elle est considérée comme la méthode la plus rapide pour déterminer la phase d’œstrus. Cependant, la plupart des études qui ont fait état de cette méthode ont utilisé des souris ; cela pourrait suggérer que cette technique est plus adaptée aux petits animaux tels que les souris et les rats. Les résultats de cette technique sont également dépendants de l’observateur.
Dans l’évaluation visuelle de la phase œstrale, la souris doit être tenue dans la main non dominante et couchée dans la contention avec les pattes avant reposant sur une surface, soulever doucement la queue, puis examiner et évaluer la vulve selon les critères de Champlin et al. Une image numérique pour la documentation est essentielle. Il est également important d’éviter les examens hâtifs pour éviter les erreurs d’interprétation.
L’aspect du vagin à différentes phases du cycle œstral est résumé dans le tableau 2. En phase de pro-œstrus, l’orifice vaginal apparaît plein, gonflé et humide. Les tissus sont roses, avec des stries sur les lèvres dorsale et ventrale de la vulve. En œstrus, le vagin apparaît semblable à celui du proestrus, mais il est moins rose, moins gonflé et moins humide, avec des stries plus marquées. En métœstrus, l’ouverture du vagin est pâle et sèche, avec un dépôt de débris cellulaires blancs. Les caractéristiques du diœstrus comprennent une ouverture vaginale très humide, parfois trop petite et fermée chez certaines souris, sans gonflement des tissus (figures 1, 2 et 3).
Apparition du vagin dans différentes phases du cycle œstral d’une souris de souche albinos suisse. a-Proestrus, b-Estrus, c- Metestrus, d- Diestrus (Ekambaram et al., )
Apparition du vagin dans différentes phases du cycle œstral d’une souris de souche agouti. a-Proestrus, b-Estrus, c- Metestrus, d- Diestrus (Byers et al., )
Apparition du vagin dans différentes phases du cycle œstral d’une souris de souche non-agouti. a-Proestrus, b-Estrus, c- Metestrus, d- Diestrus (Byers et al., )
Frottis vaginal/cytologie
Similaire à l’évaluation visuelle, la cytologie vaginale est également largement acceptée. Elle semble être la technique la plus couramment utilisée pour déterminer les phases du cycle œstral. Elle est non invasive et relativement peu coûteuse. Bien que cette méthode nécessite une certaine compétence pour l’examen microscopique des cellules des sécrétions vaginales, elle est précise et fiable. Cependant, cette méthode a également été signalée comme étant fastidieuse et chronophage.
Pendant l’évaluation, l’animal et ses pattes avant sont attachés. La queue est élevée pour visualiser le vagin. Les cellules vaginales sont rincées en introduisant doucement une petite quantité (100 μl) d’eau distillée ou de solution saline à l’aide d’une pipette ou d’une poire en latex stérile. Une solution saline tamponnée au phosphate peut être un liquide alternatif. Libérer lentement le liquide dans le vagin et le ramener dans l’embout ; cette opération doit être répétée environ 4 à 5 fois dans la même poire en latex stérile. Il est essentiel de s’assurer que la pipette ou l’ampoule en latex stérile est placée à l’entrée du canal vaginal et ne pénètre pas dans l’orifice vaginal. Le liquide contenant quelques gouttes de suspension cellulaire est ensuite introduit sur une lame de verre, séché à l’air et coloré en conséquence. Une coloration au cristal violet à 0,1% (0,1 g de poudre de cristal violet dans 100 ml d’eau bidistillée) peut être utilisée. Les autres colorants sont les colorants de type Romanowsky (tels que le Wright modifié, le Giemsa de Wright) et le bleu de Toluidine O . La lame doit ensuite être recouverte d’une lamelle couvre-objet et examinée au microscope optique immédiatement à un grossissement de 200 X.
Alternativement, un écouvillon vaginal peut être obtenu à l’aide d’un coton-tige mouillé avec du sérum physiologique à température ambiante et introduit dans le vagin de la souris immobilisée . L’écouvillon doit être tourné et roulé doucement contre la paroi vaginale, puis retiré. Les cellules recueillies sont ensuite transférées sur une lame de verre sèche en déplaçant l’écouvillon sur la lame. La lame est séchée à l’air, colorée et observée au microscope.
La sécrétion vaginale est composée de trois types de cellules. Il s’agit des leucocytes, des cellules épithéliales cornifiées et des cellules épithéliales nucléées. L’estimation de la phase du cycle œstral est basée sur la proportion de ces cellules dans la sécrétion vaginale (tableau 3 et figure 4).
Roue du cycle œstral
Des cellules nucléées rondes et nombreuses, de taille et d’aspect uniformes, caractérisent la phase pro-œstrus. Elles apparaissent en grappes ou individuellement. On trouve également quelques cellules épithéliales cornifiées anucléées. Quelques globules blancs peuvent être présents chez la femelle au début du proestrus (Fig. 5). La phase d’œstrus présente d’abondantes cellules épithéliales cornifiées anucléées. Le cytoplasme est granuleux et les cellules sont de forme irrégulière. On observe également de nombreuses bactéries et, occasionnellement, des cellules épithéliales nucléées (Figs. 6 et 7). Au moment du métœstrus, on observe un grand nombre de leucocytes et un petit nombre de grandes cellules épithéliales cornifiées, non granuleuses et anucléées. La formation du corps jaune, qui ne parvient pas à produire une lutéinisation complète en raison d’un manque de progestérone et qui entraîne la desquamation de la muqueuse utérine, explique la présence de cellules épithéliales cornées et de leucocytes polymorphonucléaires dans les écouvillons vaginaux. Quelques cellules épithéliales nucléées peuvent également être présentes à la fin du métœstrus (figures 8 et 9). Le diestrus montre des leucocytes polymorphonucléaires proéminents et quelques cellules épithéliales et cornifiées. Les leucocytes restent le type cellulaire prédominant ayant éliminé les débris cellulaires (Fig. 10).
Les frottis vaginaux au stade du proestrus chez les rates Sprague-.Dawley
Les frottis vaginaux au moment de l’œstrus chez… souris
Les frottis vaginaux à l’œstrus chez les rats Sprague. Dawley
Les frottis vaginaux au moment du métœstrus chez… souris
Les frottis vaginaux au métestrus chez les rats Sprague. Dawley
Frottis vaginaux au diestrus chez la souris (a-e) et des rats Sprague Dawley (f)
Examen histologique des organes reproducteurs
Bien que la détermination des phases du cycle œstral par cette technique soit très fiable et précise, elle présente de nombreux inconvénients. Cette technique est invasive et n’est pas utile pour l’évaluation œstrale chez les animaux de laboratoire vivants. Elle est également coûteuse et requiert un haut niveau de compétence. Enfin, elle est trop fastidieuse et prend trop de temps. Cette méthode n’est pas facilement disponible, donc pas faisable en particulier dans les zones éloignées de la région tropicale.
La condition minimale pour l’évaluation du cycle œstral par histologie est les sections longitudinales complètes du vagin et du col de l’utérus, les sections transversales de la partie médiane des deux cornes utérines, et les sections médianes des deux ovaires . La présence de follicules ovariens ne peut pas être utilisée pour déterminer la phase de l’œstrus chez les rats et les souris dont le cycle œstral est court. Les follicules sont presque toujours présents dans les ovaires à tous les stades. Cependant, l’apparition de morphologies particulières du corps jaune peut aider à la détermination de la phase œstrale, même si elle n’est pas définitive. Les organes excisés sont fixés au formol à 10%, colorés à l’hématoxyline et à l’éosine et examinés au microscope.
Les apparences histologiques des organes reproducteurs à différentes phases œstrales sont présentées dans le tableau 4 et les figures 11, 12, 13 et 14.
Impédance de la paroi vaginale
Bien que l’utilisation de l’impédance électrique de la paroi vaginale pour déterminer la phase de l’œstrus soit controversée et rarement citée dans la littérature , elle semble gagner en attention. Cette méthode est pratique, facilement disponible et nécessite moins de compétences. Elle se prête beaucoup moins à une interprétation subjective de la part de l’opérateur technique que la méthode plus conventionnelle du frottis vaginal. Cependant, elle est également coûteuse et n’est pas largement acceptée, peut-être en raison de son manque de fiabilité. Cette technique permet plutôt de différencier les animaux en œstrus de ceux qui ne le sont pas.
Un moniteur d’impédance utilisé pour cette technique est composé d’un compteur et d’une sonde vaginale (figure 15). Une personne immobilise l’animal pendant qu’une autre personne insère la sonde vaginale pendant environ 30 s pour effectuer des mesures d’impédance sur l’écran du compteur. La sonde est nettoyée avec de l’alcool à 70 % avant chaque analyse. Une autre solution consiste à utiliser un compteur électrique simple, bon marché et portable fonctionnant sur piles, qui mesure la résistance sur une large plage et qui est couramment utilisé par les électriciens, comme le décrivent Ramos et al. Lorsqu’on utilise ce dispositif alternatif, il faut y fixer des fils fabriqués à partir du câblage interne d’un câble audio blindé bon marché typique et utiliser une borne mâle comme sonde vaginale (Fig. 16).
Histologie des organes reproducteurs du rat au moment du proestrus (West wood, 2008)
Histologie des organes reproducteurs du rat en œstrus (West wood, 2008)
Histologie des organes reproducteurs du rat au Metestrus (Westwood, 2008)
Histologie des organes reproducteurs du rat au diestrus (Westwood, 2008)
Un moniteur à impédance standard
Borne mâle d’un audiocâble stéréo standard utilisé comme sonde de mesure de résistance (Ramos et al, )
Les animaux en œstrus ont une impédance vaginale plus élevée que ceux en phase de non-œstrus. Jaramillo et al. ont révélé que l’appariement d’une femelle avec des animaux mâles sur la base de l’impédance de la paroi vaginale entraînait des taux plus élevés d’accouplement confirmé ainsi que de grossesse par rapport à l’appariement basé sur le frottis vaginal. D’autre part, Singletary et al. ont observé que les rats en phase d’œstrus, déterminée par la cytologie vaginale, présentaient une impédance vaginale plus élevée que ceux qui n’étaient pas en œstrus, mais qu’il n’y avait pas de corrélation entre l’impédance vaginale et la phase du cycle œstral déterminée par la cytologie vaginale. La plupart des auteurs qui ont documenté l’utilisation de l’impédance de la paroi vaginale ont vérifié leurs résultats avec la cytologie vaginale ; par conséquent, aucune valeur de référence n’a été rapportée pour indiquer si un animal est en œstrus ou non.
Biochimie urinaire
Bien que cette méthode d’évaluation de l’œstrus n’ait pas encore gagné en popularité et en acceptation universelle, elle constitue un outil utile. Cette technique est simple, relativement bon marché et peu fastidieuse. Comme les niveaux de glucides, de protéines et d’acides gras dans l’urine sont généralement en réponse à l’œstradiol et à la progestérone ; cela pourrait varier selon les espèces et les souches. Cette méthode n’est pas spécifique et n’est pas fiable car certains animaux ont des niveaux de protéines constamment élevés dans leur urine, qui servent de signaux chimiques chez ces animaux .
Pendant l’évaluation, l’animal expérimental doit être maintenu au-dessus d’un verre de montre, et un massage abdominal doux appliqué pour stimuler la miction. L’échantillon d’urine est recueilli et tamisé à travers une étamine ou une maille de nylon (16-120 μm) au moment de la collecte. L’échantillon doit être conservé à – 20 °C s’il n’est pas analysé immédiatement . Les glucides, les protéines et les lipides/acides gras urinaires doivent être analysés à l’aide de méthodes standard.
Les niveaux de protéines et de lipides urinaires sont significativement plus élevés dans les phases de proestrus et d’œstrus. La concentration d’acides gras dans l’urine est également très supérieure en œstrus. Le taux de glucides urinaires est similaire tout au long du cycle œstral . Comme l’impédance de la paroi vaginale, il n’existe pas de rapport sur les valeurs standard de la biochimie urinaire à chaque phase du cycle œstral pour les animaux de laboratoire couramment utilisés.
Induction de l’œstrus
Lors de l’évaluation du comportement sexuel, en particulier chez les animaux mâles, ou des potentiels aphrodisiaques d’un agent/médicament particulier, il est essentiel d’amener les animaux femelles en œstrus (phase)/chaleur artificielle. Cela augmente leur réceptivité et leur disposition à s’accoupler avec leurs homologues mâles. Cette pratique est courante dans l’élevage des animaux. Elle est réalisée par l’administration d’une suspension d’éthinylestradiol à 100 μg/animal par voie orale 48 h avant l’appariement avec le mâle et de progestérone à 1 mg/animal par voie sous-cutanée 6 h avant l’appariement . Alternativement, le benzoate d’estradiol à 10 μg/100 g de poids corporel et la progestérone à 0,5 mg/100 g de poids corporel sont administrés par voie sous-cutanée respectivement 48 h et 4-6 h avant l’appariement (tableau 5). La phase d’œstrus est généralement confirmée par un frottis vaginal. La combinaison d’une évaluation visuelle et d’un frottis vaginal permet d’établir l’œstrus. La confirmation de la phase œstrale de la femelle induite se fait par l’évaluation de sa réceptivité. Pour ce faire, on les expose à un homologue mâle (non utilisé pour l’étude) avant l’expérience/le test. Les animaux femelles présentant une réceptivité maximale sont autorisés à s’accoupler.
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