Opvolgend epidemiologisch onderzoek suggereerde dat EMS in verband werd gebracht met specifieke partijen L-tryptofaan die werden geleverd door één grote Japanse fabrikant, Showa Denko. Uiteindelijk werd duidelijk dat recente partijen L-tryptofaan van Showa Denko verontreinigd waren met sporen van onzuiverheden, waarvan vervolgens werd aangenomen dat zij verantwoordelijk waren voor de uitbraak van EMS in 1989. Het L-tryptofaan werd geproduceerd door een bacterie die in open vaten in een meststoffenfabriek van Showa Denko werd gekweekt. Hoewel uiteindelijk in totaal 63 sporenverontreinigingen werden geïdentificeerd, konden slechts zes daarvan in verband worden gebracht met EMS. De verbinding EBT (1,1′-ethylideen-bis-L-tryptofaan, ook bekend als “piek E”) was de enige verontreiniging die bij de eerste analyse kon worden geïdentificeerd, maar verdere analyse bracht PAA (3-(fenylamino)-L-alanine, ook bekend als “UV-5″), en piek 200 (2-L-tryptofaan) aan het licht. Twee van de resterende ongekarakteriseerde pieken in verband met EMS werden later vastgesteld als 3a-hydroxy-1,2,3,3a,8,8a-hexahydropyrrolo–indool-2-carboxylzuur (piek C) en 2-(2-hydroxy indoline)-tryptofaan (piek FF). Deze werden gekarakteriseerd met behulp van nauwkeurige massa LC-MS, LC-MS/MS en meerfasige massaspectrometrie (MSn). De laatste van de zes verontreinigingen (piek AAA/”UV-28”, zijnde “de verontreiniging die het meest in verband wordt gebracht met EMS” is gekarakteriseerd als twee verwante keten-isomeren; Piek AAA1 ((S)-2-amino-3-(2-((S,E)-7-methylnon-1-en-1-yl)-1H-indol-3-yl)propaanzuur, een condensatieproduct tussen L-tryptofaan en 7-methylnonaanzuur) en piek AAA2 ((S)-2-amino-3-(2-[(E)-dec-1-en-1-yl)-1H-indol-3-yl)propaanzuur, een condensaat tussen L-tryptofaan en decaanzuur). Er is nooit een duidelijk verband gelegd tussen specifieke sporen van onzuiverheid of onzuiverheden die in deze partijen zijn geïdentificeerd en de effecten van EMS. Hoewel met name EBT vaak als de boosdoener is aangewezen, is er geen statistisch significant verband tussen EBT-gehalten en EMS. Van de 63 spoorverontreinigingen vertoonden alleen de twee AAA-verbindingen een statistisch significant verband met gevallen van EMS (met een p-waarde van 0,0014).
Aangezien het meeste onderzoek zich heeft toegespitst op pogingen om individuele verontreinigingen in verband te brengen met EMS, is er een relatief gebrek aan gedetailleerd onderzoek naar andere mogelijke oorzakelijke of bijdragende factoren. Tryptofaan zelf is genoemd als een mogelijk belangrijke factor die bijdraagt tot EMS. Hoewel critici van deze theorie hebben aangevoerd dat deze hypothese er niet in slaagt de vrijwel afwezige meldingen van EMS voor en na de EMS-uitbraak te verklaren, houdt dit geen rekening met de plotselinge snelle toename van het gebruik van tryptofaan onmiddellijk voorafgaand aan de uitbraak in 1989, en negeert het de sterke invloed van de erfenis van de EMS-uitbraak en het uitgebreide FDA-verbod op later gebruik van tryptofaan. Van cruciaal belang is dat dit ook voorbijgaat aan het bestaan van een aantal gevallen van EMS die zich zowel voor als na de primaire epidemie ontwikkelden, waaronder ten minste één geval waarin het tryptofaan werd getest en niet de verontreinigingen bleek te bevatten die werden aangetroffen in de besmette partijen tryptofaan van Showa Denko, alsmede gevallen met andere supplementen die EMS veroorzaakten, en zelfs een geval van EMS dat werd veroorzaakt door een overmatige inname van L-tryptofaan via de voeding via overconsumptie van cashewnoten. Een grote Canadese analyse vond een aantal patiënten die voldeden aan de CDC criteria voor EMS, maar die nooit waren blootgesteld aan tryptofaan, wat “causale interpretaties van eerdere studies in twijfel trekt”. Andere studies hebben gewezen op talrijke belangrijke tekortkomingen in veel van de epidemiologische studies naar het verband tussen tryptofaan en EMS, die ernstige twijfel doen rijzen over de geldigheid van hun resultaten. Zoals de FDA concludeerde, “andere merken van L-tryptofaan, of L-tryptofaan zelf, ongeacht de niveaus of de aanwezigheid van onzuiverheden, konden niet worden geëlimineerd als oorzakelijk of bijdragend tot de ontwikkeling van EMS”. Zelfs dierstudies hebben gesuggereerd dat tryptofaan zelf “bij inname door vatbare personen, alleen of in combinatie met een ander bestanddeel van het product, leidt tot de pathologische kenmerken van EMS”.
Op het moment van de uitbraak had Showa Denko onlangs wijzigingen aangebracht in haar productieprocedures die verband zouden kunnen houden met de mogelijke oorsprong van de verontreinigingen die waren aangetroffen in de getroffen partijen tryptofaan. Een belangrijke wijziging was de verlaging van de hoeveelheid actieve kool die werd gebruikt om elke partij te zuiveren van >20 kg naar 10 kg. Een deel van de verontreinigde partijen had ook een andere filtratiestap omzeild waarbij omgekeerde osmose werd gebruikt om bepaalde onzuiverheden te verwijderen. Bovendien was de bacteriecultuur die gebruikt werd om tryptofaan te synthetiseren een stam van Bacillus amyloliquefaciens die genetisch gemanipuleerd was om de tryptofaanproductie te verhogen. Hoewel de vorige vier generaties van de genetisch gemanipuleerde stam zonder incidenten waren gebruikt, werd de vijfde generatie die voor de besmette partijen werd gebruikt, beschouwd als een mogelijke bron van de onzuiverheden die werden ontdekt. Dit werd misbruikt om aan te voeren dat de genetische manipulatie zelf de primaire oorzaak van de verontreiniging was, een standpunt dat zwaar werd bekritiseerd omdat het andere bekende, niet genetisch gemodificeerde oorzaken van verontreiniging over het hoofd zag, en ook omdat het door anti-GMO-activisten werd gebruikt als een manier om de ontwikkeling van de biotechnologie met valse informatie te bedreigen. De vermindering van de hoeveelheid gebruikte actieve kool en de invoering van de vijfde generatie Bacillus amyloliquefaciens-stam werden beide in verband gebracht met de ontwikkeling van EMS, maar door de grote overlapping van deze veranderingen kon de precieze onafhankelijke bijdrage van elke verandering niet worden vastgesteld (hoewel werd vastgesteld dat de bypass van de omgekeerde-osmosefiltratie voor bepaalde partijen geen significant verband hield met de besmette partijen tryptofaan). Hoewel Showa Denko een zuiverheid van 99,6% claimde, werd opgemerkt dat “de hoeveelheden van de bekende met EMS geassocieerde verontreinigingen, EBT en PAA, opmerkelijk klein waren, in de orde van grootte van 0,01%, en gemakkelijk aan opsporing konden ontsnappen”.
Reactie van de regelgeverEdit
De FDA versoepelde haar beperkingen op de verkoop en marketing van tryptofaan in februari 2001, maar bleef de invoer van tryptofaan dat niet voor een vrijgesteld gebruik bestemd was, tot 2005 beperken.