Vind bronnen: “Hybridization probe” – nieuws – kranten – boeken – scholar – JSTOR (december 2009) (Leer hoe en wanneer u dit sjabloonbericht verwijdert)
In de moleculaire biologie is een hybridization probe een fragment DNA of RNA van variabele lengte (meestal 100-10000 basen lang) dat radioactief of fluorescent gelabeld kan worden. De probe kan vervolgens in DNA- of RNA-monsters worden gebruikt om de aanwezigheid te detecteren van nucleotiden (het RNA-doel) die complementair zijn aan de sequentie in de probe. De probe hybridiseert daarbij aan enkelstrengs nucleïnezuur (DNA of RNA) waarvan de basensequentie door de complementariteit tussen de probe en het doelwit basenparing mogelijk maakt. De gelabelde probe wordt eerst gedenatureerd (door verhitting of onder alkalische omstandigheden zoals blootstelling aan natriumhydroxide) tot enkelstrengs DNA (ssDNA) en vervolgens gehybridiseerd aan het op een membraan geïmmobiliseerde of in situ geïmmobiliseerde ssDNA (Southern blotting) of RNA (northern blotting) van het doelwit.Om hybridisatie van de probe aan de doelsequentie te detecteren, wordt de probe gemerkt (of “gelabeld”) met een moleculaire merker van radioactieve of (recenter) fluorescerende moleculen; algemeen gebruikte merkers zijn 32P (een radioactieve isotoop van fosfor die in de fosfodiësterbinding in het probe-DNA is opgenomen) of digoxigenine, dat een niet-radioactieve merker op basis van antilichamen is. DNA-sequenties of RNA-transcripten die een matige tot grote sequentieovereenkomst met de probe vertonen, worden vervolgens gedetecteerd door de gehybridiseerde probe zichtbaar te maken met behulp van autoradiografie of andere beeldvormingstechnieken. Gewoonlijk worden van het filter röntgenfoto’s gemaakt of wordt het filter onder UV-licht geplaatst. Detectie van matig of sterk op elkaar lijkende sequenties hangt af van de strengheid van de hybridisatiecondities: een hoge strengheid, zoals een hoge hybridisatietemperatuur en een laag zoutgehalte in de hybridisatiebuffers, maakt alleen hybridisatie mogelijk tussen nucleïnezuursequenties die sterk op elkaar lijken, terwijl een lage strengheid, zoals een lagere temperatuur en een hoog zoutgehalte, hybridisatie mogelijk maakt wanneer de sequenties minder op elkaar lijken. Hybridisatieprobes die in DNA-microarrays worden gebruikt, zijn DNA’s die covalent aan een inert oppervlak zijn gehecht, zoals gecoate glasplaatjes of genchips, waaraan een mobiel cDNA-doelwit is gehybridiseerd.
Afhankelijk van de methode kan de probe worden gesynthetiseerd met de fosforamidietmethode, of hij kan worden gegenereerd en gelabeld door PCR-amplificatie of klonering (beide zijn oudere methoden). Om de in vivo stabiliteit van de probe te vergroten wordt geen RNA gebruikt. In plaats daarvan kunnen RNA-analogen worden gebruikt, met name morfolinederivaten. Probes op basis van moleculair DNA of RNA worden thans routinematig gebruikt bij het screenen van genbibliotheken, het opsporen van nucleotidesequenties met blottingmethoden, en in andere gentechnologieën, zoals nucleïnezuur- en weefselmicroarrays.