Cabrillo verscheepte als jongeman naar Havana en sloot zich aan bij Hernán Cortés in Mexico (dat toen Nieuw-Spanje heette). Later werd hij door zijn succes bij het delven van goud in Guatemala een van de rijkste van de conquistadores in Mexico. Volgens zijn biograaf Harry Kelsey nam hij een inheemse vrouw tot echtgenote en verwekte hij verschillende kinderen, waaronder minstens drie dochters. Later trouwde hij in Sevilla met Beatriz Sanchez de Ortega tijdens een onderbreking in Spanje. Zij keerde met hem terug naar Guatemala en baarde hem twee zonen.
Cabrillo profiteerde van het encomienda-systeem dat de inheemse volken van de Amerika’s tot slaaf maakte. In Honduras, bijvoorbeeld, brak hij gezinnen op en stuurde de mannen naar de mijnen voor goud en naar het bos om materialen te oogsten die hij nodig had voor de scheepsbouw. De vrouwen en meisjes gaf hij aan zijn soldaten en zeelieden, vermoedelijk als slaven.
Hij vergezelde Francisco de Orozco bij het onderwerpen van het inheemse Mixteekse volk in wat uiteindelijk de stad Oaxaca zou worden, in Mexico. Er is weinig bekend over wat Cabrillo daar deed.
In 1539 ontdekte Francisco de Ulloa, die in opdracht van Cortés reisde, de Golf van Californië en bereikte bijna het noorden van de 30e breedtegraad. Cabrillo kreeg toen van de nieuwe onderkoning van Nieuw-Spanje, Antonio de Mendoza, de opdracht een expeditie te leiden langs de kust van de Stille Oceaan op zoek naar handelsmogelijkheden, misschien om een weg naar China te vinden (want de volledige omvang van de noordelijke Stille Oceaan was onbekend) of om de mythische Straat van Anián (of Noordwestelijke Doorgang) te vinden die de Stille Oceaan met Hudson Bay zou verbinden. Cabrillo bouwde en bezat het vlaggenschip van zijn onderneming (twee of drie schepen), en zou profiteren van eventuele handel of schatten.
In 1540 voer de vloot uit vanuit Acajutla, El Salvador, en bereikte Navidad, Mexico op eerste kerstdag. In Mexico ging Pedro de Alvarado de stad Nochistlán te hulp, die werd belegerd door vijandige inboorlingen. Hij werd gedood toen zijn paard op hem viel en zijn borst verbrijzelde. Na Alvarado’s dood nam de onderkoning bezit van Alvarado’s vloot. Een deel van de vloot werd onder leiding van Ruy López de Villalobos naar de Filippijnen gestuurd en twee van de schepen werden onder bevel van Cabrillo naar het noorden gestuurd.
Op 27 juni 1542 vertrok Cabrillo vanuit Navidad met drie schepen: het 200 ton metende galjoen en vlaggenschip San Salvador, de kleinere La Victoria (ca. 100 ton), en de laat getuigde, zesentwintig roede tellende “fragata” of “bergantin” San Miguel. Op 1 augustus ging Cabrillo voor anker bij het eiland Cedros. Voor het einde van de maand waren ze Baja Point (door de Ulloa in 1539 “Cabo del Engaño” genoemd) gepasseerd en “onbekende wateren binnengevaren, waar nog nooit Spaanse schepen waren geweest”. Op 28 september landde hij in wat nu San Diego Bay is en noemde het “San Miguel”. Iets meer dan een week later bereikte hij het eiland Santa Catalina (7 oktober), dat hij “San Salvador” noemde, naar zijn vlaggenschip. Toen hij een boot naar het eiland stuurde “verscheen er een grote menigte gewapende Indianen” – met wie zij later echter “bevriend raakten”. Het nabijgelegen eiland San Clemente kreeg de naam “Victoria”, ter ere van het derde schip van de vloot. De volgende ochtend, 8 oktober, kwam Cabrillo aan in de Baai van San Pedro, die de naam “Baya de los Fumos” (Engels: Rook Baai) kreeg. De volgende dag gingen ze ’s nachts voor anker in Santa Monica Bay. Op weg naar de kust zag Cabrillo Anacapa Island, waarvan ze van de Indianen hoorden dat het onbewoond was.
De vloot bracht de volgende week door op de eilanden, meestal voor anker liggend in Cuyler Harbor, een baai aan de noordoostelijke kust van San Miguel Island. Op 18 oktober zag de expeditie Point Conception, dat ze de naam “Cabo de Galera” gaven.Cabrillo’s expeditie noteerde in oktober 1542 de namen van talrijke Chumash-dorpen aan de Californische kust en de aangrenzende eilanden – toen gelegen in de twee strijdende provincies Xexo (geregeerd door een “oude vrouw”, nu Santa Barbara County, Californië) en Xucu (nu Ventura County, Californië).
Op 13 november zagen zij “Cabo de Piños” (mogelijk Point Pinos of Point Reyes), maar misten de ingang van San Francisco Bay, een vergissing die zeelieden de komende twee eeuwen en langer zouden herhalen, waarschijnlijk omdat de ingang vaak door mist wordt gehuld. De expeditie is misschien wel tot aan de Russian River of zelfs de Columbia gevaren voordat de herfststormen hen dwongen om te keren. Door de vaagheid van zijn beschrijving is het niet zeker welke noordelijke rivier de expeditie heeft gezien. Terug langs de kust voer Cabrillo Monterey Bay binnen en noemde het “Bahia de Los Piños”.
Op 23 november 1542 arriveerde de kleine vloot weer in “San Salvador” (Santa Catalina Island) om te overwinteren en reparaties uit te voeren. Daar, rond kerstavond, stapte Cabrillo uit zijn boot en verbrijzelde zijn scheenbeen toen hij struikelde over een grillige rots terwijl hij probeerde enkele van zijn mannen te redden van aanvallende Tongva krijgers. De verwonding raakte geïnfecteerd en ontwikkelde gangreen, en hij stierf op 3 januari 1543 en werd begraven. Een mogelijke grafsteen werd later gevonden op het eiland San Miguel. Zijn tweede-in-bevelhebber bracht de rest van de groep terug naar Navidad, waar ze aankwamen op 14 april 1543.
Een notarieel verslag van Cabrillo’s expeditie ging verloren; het enige dat overleefde is een samenvatting ervan gemaakt door een andere onderzoeker, Andrés de Urdaneta, die ook toegang had tot scheepsjournaals en kaarten. Geen enkel gedrukt verslag van Cabrillo’s reis verscheen vóór het verslag van historicus Antonio de Herrera in het begin van de 17e eeuw.