High-Throughput Advances for Chronological Life Span and New Attention for Quiescent Cells
CLS in S. cerevisiae en S. pombe gebruikt vergelijkbare assays om te bepalen hoe lang cellen kunnen overleven in vloeibare cultuur nadat de glucose en verschillende andere voedingsstoffen zijn uitgeput (Longo et al., 2012; Chen en Runge, 2009, 2012; Fabrizio en Longo, 2003; Zuin et al., 2008, 2010). Omdat cellen door verhongering stilvallen, spelen nutriëntdetectie en afbraak van interne eiwitcomponenten door autofagie een belangrijke rol in CLS (Sideri et al., 2014; Yamaguchi and Otsu, 2012; Alvers et al., 2009a,b; Aris et al., 2012, 2013). Bij het ontwerpen van CLS-assays moeten enkele belangrijke punten in gedachten worden gehouden. Ten eerste, als de CLS assay model moet staan voor andere organismen, dan moet de assay dezelfde effecten hebben op gist als de analoge assay doet op andere modellen. Voor de meeste organismen omvatten deze kenmerken een verlenging van de levensduur door calorische restrictie, en deze langlevende cellen zijn vaak resistent tegen stress (bv. Fabrizio et al., 2001). Hoewel de condities lang geleden werden vastgesteld voor S. cerevisiae, bootst het primaire synthetische medium dat gebruikt wordt in het veld van S. pombe, Edinburgh Minimal Medium (EMM of EMM2) genaamd, deze geconserveerde kenmerken van levensduur en calorische restrictie niet na (Chen en Runge, 2009). In plaats daarvan vereist S. pombe ofwel een rijk YES-medium (gistextract (YE) en supplementen (S) en koolstofbron) of een medium genaamd SD (een synthetisch, chemisch afgeleid medium (S) plus dextrose (D)) met verschillende niveaus van componenten dan EMM (Chen en Runge, 2009; Zuin et al., 2010). Ten tweede moet de assay informatie over het modelorganisme bevatten. S. cerevisiae en S. pombe kunnen snel hele populaties kweken uit één enkele cel, iets wat bij mensen of muizen niet mogelijk is. Gisten kunnen derhalve hun kernmechanismen anders reguleren wanneer de meeste cellen in de cultuur afsterven (bv. van ∼108 tot 10 cellen/mL) dan wanneer het aantal cellen daalt tot 1% van het oorspronkelijke niveau (van ∼108 tot 106 cellen/mL). In feite gedragen S. cerevisiae zich in een CLS-assay op een complexe manier, want wanneer het aantal cellen in een CLS-assay daalt tot ∼0,1% van de oorspronkelijke dichtheid van levende cellen per ml, begint een fractie van de cellen opnieuw te groeien (Fabrizio et al., 2004) (Fig. 30.2B). De cellen vergiftigen zichzelf ook door kleine organische zuren (bv. azijnzuur) in het medium uit te scheiden (Burtner et al., 2009). Dit complexe gedrag maakt het noodzakelijk dat de meeste S. cerevisiae CLS-tests niet veel verder gaan dan een verlies in levensvatbaarheid van minder dan 1%. In tegenstelling, kan de S. pombe CLS assay tonen een daling van de levensvatbaarheid van 5-6 orden van grootte zonder hergroei, waardoor men gemakkelijker te isoleren langlevende cellen (Chen en Runge, 2009; Chen et al., 2013).
Zowel S. cerevisiae en S. pombe zijn gebruikt om hun respectieve genoom-brede deletie stammen sets te screenen op mutanten met uitgebreide CLS. Elke gen-deletie is gemerkt met een unieke DNA-sequentie of -barcode. Deze CLS-tests omvatten overleving in microtiterplaten (Powers et al., 2006) of de standaardtest met gebruikmaking van de streepjescodes die met de deleties geassocieerd zijn om de mutanten te identificeren die met verschillende levensduren geassocieerd zijn. De barcodefrequenties zijn bepaald met behulp van microarray hybridisatie (Wei et al., 2008) of barcode sequencing benaderingen (Chen et al., 2013; Sideri et al., 2014). Bijkomende genen die CLS verlengen bij overexpressie zijn ook geïdentificeerd (Ohtsuka et al., 2009; Miwa et al., 2011). Hoewel de lijst van genen die de levensduur reguleren hier niet zal worden besproken, is het belangrijk op te merken dat TOR in beide gisten naar voren is gekomen als een belangrijke regulator van de levensduur (Powers et al., 2006; Wei et al., 2008; Sideri et al., 2014). In het algemeen hebben de standaard CLS assays veel informatie opgeleverd die het belang benadrukt van een set evolutionair geconserveerde pathways die veroudering controleren (Longo et al., 2012).
De resultaten van de CLS assays leveren enkele puzzels op. Waarom zijn S. cerevisiae zo variabel aan het eind van CLS? Waarom heeft S. pombe zo’n korte CLS (14 dagen)? Hoewel de antwoorden op deze vragen niet bekend zijn, is een mogelijkheid dat de assays niet gewaardeerde evolutionaire kenmerken in beide soorten missen. Een dergelijk kenmerk dat gewoonlijk niet wordt overwogen, is een andere gedifferentieerde toestand van gist die voorkomt in CLS-assays, de rustende G0-cel of Q-cel.
Wanneer S. cerevisiae tot verzadiging groeien en in cultuur blijven, differentieert een fractie van de cellen in kleine, dichte cellen die kunnen worden geïsoleerd, weg van de rest van de populatie (Allen et al., 2006) (Fig. 30.2D). Recentere studies hebben aangetoond dat Q-cellen kunnen worden weggesorteerd van de andere cellen door fluorescentie-geactiveerde celsortering voor analyse (Miles en Breeden, 2017). Deze cellen hebben opmerkelijke eigenschappen op het gebied van CLS. Ze kunnen bijna 1 jaar in water overleven, zijn zeer stressbestendig, en gaan synchroon opnieuw de celcyclus in wanneer er voedingsstoffen aan worden toegevoegd (Allen et al., 2006; Miles and Breeden, 2017). Het feit dat ze zich enkele dagen na het begin van een CLS vormen, geeft aan dat ze waarschijnlijk een rol spelen bij de analyse van CLS-cellen. Of de inmiddels gewaardeerde aanwezigheid van Q-cellen in de S. cerevisiae CLS-assays enig verschil maakt voor de eerdere conclusies die daaruit getrokken zijn, is op dit moment onduidelijk. Het Breeden lab heeft de afgelopen jaren S. cerevisiae Q-cellen intensief geanalyseerd, en er is aangetoond dat transcriptionele repressoren en chromatine remodelers (bijv. Xbp1 en Rpd3) een sleutelrol spelen in dit proces (Miles en Breeden, 2017; Miles et al., 2013; McKnight et al., 2015). Eiwitten waarvan bekend is dat ze een rol spelen in de G1/S-overgang van de celcyclus hebben ook een rol in de overgang naar quiescentie (bijv. het SBF-transcriptiecomplex), en deze kerncomplexen worden aangepast aan quiescentie-inductie door de overname van andere factoren (bijv. Msa1 en Msa2) (Miles et al., 2016). Dus, door gebruik te maken van informatie van fietsende cellen, wordt de kern cellulaire machinerie die ingang regelt in G0 opgehelderd. Zoals het identificeren van dergelijke kern machineries zijn een belangrijk doel van veroudering onderzoek, dit werk is een belangrijke stap voorwaarts. Een belangrijke toekomstige inspanning zal zijn om te bepalen welke andere cellulaire processen deze geconserveerde pathways controleren.
Quiescence in S. pombe is enigszins anders. Bij de paring van S. pombe in het laboratorium worden twee cellen van tegengestelde paringstypen bij elkaar geplaatst op een medium zonder gereduceerde stikstof (-N-medium). Het stikstofgebrek induceert een signaal dat het paringsprogramma in gang zet en leidt tot sporulatie om haploïde sporen te produceren. Wanneer echter geen paringspartner aanwezig is, komen de cellen langzaam in een G0-status, die wordt gekenmerkt door de staafvormige S. pombe, en worden kleine, ronde cellen. Deze cellen kunnen maanden overleven en komen opnieuw in de celcyclus als er weer stikstof aan het medium wordt toegevoegd en zijn dus Q-cellen voor deze soort (Su et al., 1996; Yanagida, 2009). Belangrijk is dat deze Q-cellen niet worden waargenomen in culturen die stoppen met groeien doordat hun glucosevoorraden uitgeput raken (besproken in Yanagida, 2009). Aangezien glucose-uitputting de oorzaak is van arrestatie tijdens S. pombe CLS (Fig. 30.2E), lijkt het onwaarschijnlijk dat de kleine ronde Q-cellen een belangrijke rol spelen in deze assays.
Er is een aanzienlijke hoeveelheid transcriptoom analyse en karakterisering gedaan om te bepalen welke genen nodig zijn voor het maken van S. pombe Q-cellen. Dit heeft geresulteerd in de identificatie van genen voor eiwitten die in bijna elk cellulair compartiment actief zijn (Yanagida, 2009; Shimanuki et al., 2007). Een belangrijke uitdaging is om te bepalen hoe deze vele spelers worden gecoördineerd om de oprichting, instandhouding en ontmanteling van de Q-cel toestand te regelen, in feite het tegenovergestelde van de situatie in S. cerevisiae, waar delen van de kern machinerie bekend zijn. Toekomstig werk zal uitwijzen hoe goed informatie van deze twee gisten kan helpen bij het opvullen van onze leemtes in het begrijpen van de Q-celtoestand en of er fundamentele verschillen bestaan zoals we die zien bij replicatieve veroudering.