Home Documenten Opdrachten Wiki Schema Wiki Pagina’s Cursus Syllabus
De nieuwe benadering van weefselregeneratie
Een van de meest kritieke momenten op het gebied van weefselmanipulatie vond plaats in 1954 in de stad Boston in een project onder leiding van dr. Joseph Murray. Onder zijn leiding voerde een team van artsen met succes de eerste transplantatie van een vast orgaan uit. In dit geval werd een nier van een eeneiige tweeling getransplanteerd bij zijn ernstig zieke broer. Deze gebeurtenis stimuleerde een wijdverspreide onderzoeksbeweging waarbij wetenschappers en laboratoria uitgebreid werk begonnen te verrichten op het gebied van transplantatiebiologie, immunologie en andere verwante disciplines. Dit onderzoek ging gepaard met aanzienlijke vooruitgang in de ontwikkeling van chirurgische technieken en in pogingen om de immuunsuppressie van de gastheer te verbeteren. Zelfs tientallen jaren later staan er echter nog heel wat uitdagingen in de weg tussen weefseltransplantaties en klinisch succes. Enkele van deze uitdagingen zijn de kosten die verbonden zijn aan de eigenlijke transplantatieprocedure, de noodzakelijke arbeidsintensieve zorg en de grote kans op afstoting door de gastheer. Tot op de dag van vandaag is het voornaamste probleem het fundamentele probleem van de schaarste aan organen en donoren (1).
De meeste onderzoekslaboratoria richtten hun aandacht tot in de jaren tachtig op manieren om het “immuunprobleem” te bestrijden en de orgaantransplantatietechnologie te verbeteren en er werden ontwikkelingen doorgevoerd waarbij gebruik werd gemaakt van xenograften en biohybride ondersteuningsmiddelen. Pas in het midden van de jaren tachtig, toen Joseph Vacanti, MD van het Children’s Hospital in Boston een team vormde met Dr. Robert Langer van de afdeling polymeerwetenschappen van MIT, werd het idee om daadwerkelijk functioneel weefsel voor gebruik bij transplantatie te ontwikkelen een potentiële oplossing om het probleem van de orgaanschaarste te bestrijden. Samen zouden ze het vakgebied van weefselmanipulatie opnieuw definiëren (1).
De “visie”
Het concept
Vacanti en Langer wilden een systeem ontwikkelen waarmee nieuwe en natuurlijke permanente weefselvervangingen konden worden gegenereerd met behulp van 3D-synthetische, biologisch afbreekbare matrices die werden ingezaaid met parenchymale cellen. Conceptueel bevatte dit idee veel van de antwoorden op de huidige problemen in verband met weefselvervanging. Idealiter zou de polymeersteiger zo ontworpen kunnen worden dat hij celproliferatie en -differentiatie bevordert, vasculaire ingroei mogelijk maakt, controleerbaar afgebroken kan worden en in vivo volledig resorbeert, waarbij alleen het nieuw gevormde weefsel overblijft. Indien succesvol, kan de ontwikkeling en implementatie van dit apparaat een aantal voordelen ten opzichte van traditionele methoden, zoals de steiger zou kunnen worden gemanipuleerd om meer controle over de afgifte van hormonen en groeifactoren essentieel voor celfunctionaliteit, de gehechtheid aan de cellen aan de matrix voor de introductie in het lichaam kan het aantal cellen in staat om te worden geïmplanteerd te verhogen, de mal kan worden gestructureerd in verschillende vormen, en deze methode zou kunnen zorgen voor autologe of allogene transplantaties (1).
Voorlopige gegevens en ondersteunend bewijs
Bij hun onderzoek baseerden de gebroeders Vacanti en Langer zich op een aantal fundamentele waarnemingen die in voorstudies werden verzameld. Ten eerste ondergaan alle organismen voortdurend het proces van vernieuwing, remodellering en vervanging van hun cellen. Ten tweede zijn cellen die zijn losgekoppeld van hun natuurlijke omgeving, in staat om structuren te hervormen wanneer zij daartoe een signaal krijgen van hun omgeving. Ten derde zijn orgaanparenchymcellen afhankelijk van de celmatrix en spelen zij een essentiële rol bij de celvorm, -deling en -differentiatie. Ook hebben eerdere studies aangetoond dat 2-3 mm3 het grootste volume weefsel is dat kan worden geïmplanteerd en dat voldoende voeding, gasuitwisseling, enz. mogelijk maakt totdat angiogenese optreedt. Met deze biologische waarnemingen in het achterhoofd begonnen de gebroeders Vacanti en Langer een nieuwe 3D-polymeersteiger te ontwerpen die kon worden geladen met paranchymale orgaancellen in cultuur en vervolgens in een gastheer kon worden geïmplanteerd (1).
De ideale matrix
Eén van de belangrijkste overwegingen bij het ontwerp van deze polymeersteiger voor de engineering van vervangingsweefsels is de keuze van een geschikt matrixmateriaal. Dit ideale steigermateriaal zou een aantal essentiële eigenschappen en afstemmingsmogelijkheden moeten hebben voor een goede functionaliteit in deze toepassing, want het moet biocompatibel, mechanisch stabiel, flexibel, controleerbaar afbreekbaar, resorbeerbaar en in staat tot het maken van specifieke chemische interacties met de gezaaide cellen zijn. Wat de biocompatibiliteit betreft, is het van essentieel belang dat het polymeer geen ongewenste immuunreactie in de gastheer opwekt, die uiteindelijk kan leiden tot afstoting door het immuunsysteem en mislukking van de procedure. Fysisch gezien moet de matrix een bepaalde mate van mechanische stabiliteit en flexibiliteit bezitten om de nodige steun en ruimte te kunnen bieden voor weefselvorming, zodat hij gemakkelijk kan worden ontworpen en geconstrueerd in variabele vormen en structuren, en moet hij bestand zijn tegen de procedure en de in vivo omgeving, zodat deze structuur na implantatie behouden blijft. Ten slotte zou de ideale polymeersteiger moeten kunnen worden afgestemd op de afbraakkarakteristieken, moet de matrix in het lichaam kunnen resorberen, waarbij alleen natuurlijk, functioneel weefsel overblijft, en moet de oppervlaktechemie kunnen worden gemanipuleerd om de gewenste interacties tussen de cellen en het oppervlak van de matrix te kunnen bepalen (1).
De gebroeders Vacanti en Langer stelden vast dat polymeren uit de groep van polyesters en de families van polylactische zuren, polyglycolzuren, en hun copolymeren de beste kandidaat waren voor hun steigermateriaal. Deze polymeren waren niet alleen biocompatibel, stabiel en flexibel, maar konden ook door hydrolyse worden afgebroken tot kooldioxide- en waterproducten en de resorptiesnelheid van het polymeer kon worden ingesteld op een tijdschaal van maanden tot jaren, afhankelijk van de verhouding tussen de gebruikte polymeermonomeren (1).
Steps to Reality
De jaren na de Vacanti-Langer-paring in 1985 werden gekenmerkt door snelle experimenten en ontwikkelingen op het gebied van weefselmanipulatie om de haalbaarheid van het beoogde steigerapparaat voor weefselregeneratie te verduidelijken.
Een van de eerste experimenten maakte gebruik van een kleine schijf polyanhydride waarin hepatocyten in een monolaag op de schijf werden uitgezaaid en in het dier werden geïmplanteerd (zie figuur 3). Uit analyse bleek dat het aantal en de dichtheid van de cellen niet voldoende waren voor een succesvolle enting (1). Dit experiment leidde echter tot de realisatie van een fundamentele beperking. Alle cellen vereisen een adequate uitwisseling van zuurstof en voeding met de omgeving en verwijdering van afvalproducten. Aangezien massatransfer alleen plaatsvindt aan het extracellulaire oppervlak, is het relatief gemakkelijk om dit te bereiken voor een enkele laag cellen. Naarmate de celmassa toeneemt, neemt ook het oppervlak voor uitwisseling toe, evenals de massa van de cellen die deze uitwisseling nodig hebben. Bij de ontwikkeling van steigervormen moet dus rekening worden gehouden met deze overwegingen om een adequate voedingsverwerving en overleving mogelijk te maken (2). Zoals Joseph Vacanti dit probleem zo welsprekend beschreef: “…je kunt net zo goed proberen een kamerplant in een basketbal te laten groeien (3)”. In zijn zoektocht naar een antwoord op dit fundamentele probleem, beweert Vacanti dat het idee bij hem opkwam toen hij tijdens een familievakantie zeewier observeerde aan de kust van Cape Cod. Onder de huid van het zeewier bevindt zich een vertakt netwerk van holle takken die voldoen aan de vereisten van oppervlakte-volume en het organisme van verse zuurstof voorzien terwijl afvalproducten worden afgevoerd. Dit zeewierontwerp van een vertakt netwerk inspireerde tot het gebruik van veel luchtigere, “wattenbolachtige” polymeren in toekomstige experimenten (2).
Diverse jaren later, in 1991, vond een andere belangrijke experimentele doorbraak plaats onder leiding van Dr. Charles Vacanti aan de University of Massachusetts Medical School (1). De groep was in staat om met succes homogene kraakbeenplaten met een gewicht tot 100 mg te ontwikkelen, door gebruik te maken van synthetische, biologisch afbreekbare sjablonen geladen met chondrocyten. Deze steigers werden vervolgens geïmplanteerd onder de huid van athymische muizen en geanalyseerd. Het nieuw gevormde kraakbeen behield de relatieve vorm en afmetingen van de originele sjablonen na resorptie van het polymeer. Bovendien werden lacunes waargenomen in specimens die na 81 dagen geoogst werden en niet in deze die na 49 dagen of vroeger geoogst werden. Deze bevindingen suggereren dat het weefsel rijpte van metaal tot volwassen kraakbeen. Om deze conclusie verder te ondersteunen werd type III collageen, dat kenmerkend is voor onvolgroeid hyalien kraakbeen van zoogdieren, waargenomen in de jongere stalen, terwijl type II collageen, dat kenmerkend is voor volgroeid kraakbeen van zoogdieren, werd waargenomen in stalen die langer dan 49 dagen geïmplanteerd waren (1). De volgende praktische stap op weg naar de ontwikkeling van de beoogde steiger bestond uit de engineering van kraakbeen in specifieke vooraf bepaalde vormen en gedaantes. Dit werd uitgevoerd door Puelacher et al. in 1993 toen zij modellen van menselijk neuskraakbeen ontwikkelden met behulp van niet-geweven PGA mazen die gebonden werden met een 5% oplossing van polymelkzuur. Deze polymeervormen werden gezaaid met een suspensie van chrondrocyten verkregen uit pasgeboren bovien hyalien kraakbeen. Deze structuren werden vervolgens geïmplanteerd in athymische muizen gedurende 8 weken. Analyse toonde aan dat de grootte en de vorm van de implantaten behouden bleven bij polymeerresorptie, waardoor een relatief veerkrachtig weefsel achterbleef dat in staat was zijn oorspronkelijke bevestiging te herstellen na buiging (1).
The Classic Mouse Experiment
The Objective
Totale oorreconstructie is een zeer uitdagende kwestie voor plastisch chirurgen vanwege de complexe structuur van het oor en het weefsel heeft een beperkt vermogen om te regenereren (2). Er zouden echter grote klinische voordelen verbonden zijn aan een verbeterde regeneratiemethode voor zuigelingen die dagelijks worden geboren met onderontwikkelde oren en anderen die deze organen verliezen bij traumatische ervaringen (1). Momenteel zijn er twee belangrijke alternatieven voor totale uitwendige oorreconstructie: alloplastische implantaten en autogene kraakbeentransplantaten. Alloplastische implantaten worden meestal vervaardigd uit silicone of polypropyleen in voorgevormde vormen. Een voordeel van deze methode is dat de materialen relatief onbeperkt beschikbaar zijn en dat er geen extra arbeid of tijd nodig is om het implantaat vorm te geven, aangezien ze voorgevormd worden geleverd. Deze materialen zijn echter zeer vatbaar voor infecties en vertonen geen consistente duurzaamheid op lange termijn. Anderzijds heeft het gebruik van autogeen weefsel een betere duurzaamheid op lange termijn, maar er is een wisselwerking: er is veel tijd nodig om de steiger te vormen en er is vaak een onvoldoende aanbod van bruikbaar kraakbeen (4).
In de jaren negentig lieten Vacanti en Langer met succes een oor groeien op de rug van een athymische muis die zij de bijnaam Auriculosaurus gaven (3) (zie figuur_).
De wetenschap erachter
Bouw van het apparaat
Om de werkelijke vorm en afmetingen van het steigertoestel te construeren, werd het oor van een 3-jarig kind afgegoten met alginaat als afdrukmateriaal. Van de alginaatafdruk werd vervolgens een gipsafgietsel gemaakt dat als mal werd gebruikt voor het ontwerp van de synthetische, biologisch afbreekbare polymeerconstructies. Het gebruikte polymeer bestond uit polyglycolzuurvezels in een niet-geweven netwerk dat ongeveer 100 mm dik was met een diameter van ongeveer 15 mm. De gaasvezels werden vervolgens gebonden na onderdompeling in een 1% oplossing van polymelkzuur gedurende 2 seconden. Na dit proces, werd het polymeer gevormd in de vorm van het oor met behulp van de gips mal en de apparaten werden geplaatst in 35-mm polystyreen weefselkweekschaaltjes (4).
Osolatie van Chondrocyten
Volgens Cao et al., werden de chondrocyten verkregen uit “vers geslachte” kalf voorelimben na ontvangst van het plaatselijke slachthuis. De cellen werden verwijderd uit de articulaire oppervlakken van de gewrichten en onderworpen aan collagenase digestie, centrifugatie, filtratie, en verschillende bufferende voorwaarden ter voorbereiding van het seeding proces (4).
Het laden van de polymeer en implantatie in Athymic muizen
Om zaad de polymeren met de gedissocieerde rundercellen, 3 mL aliquots van de chondrocyt suspensie bestaande uit 1,5×10 ^ 8 cellen geplaatst op de polymeren en gedurende 4 uur bij 37 graden Celsius incuberen om gehechtheid aan de vezels (zie figuur_) te bevorderen. Het kweekmedium werd verrijkt met 10% foetaal kaldoserum, 5 ug/mL ascorbinezuur, 292 ug/mL L-glutamine, 100 U/mL penicilline en 100 ug/mL streptomycine. De matrices werden gedurende 1 week geïncubeerd bij 37 graden Celsius in 5% CO2 en het kweekmedium werd om de 48 uur vervangen (papier). Rasterelektronenmicroscoopbeelden tonen de aanhechting van de chrondrocyten aan de matrix vóór de incubatie en tonen ook de aanwezigheid van extracellulaire matrixcomponenten die door de cellen worden uitgescheiden, wat hun respectieve vermogen om gedifferentieerde functies uit te voeren bevestigt.Na incubatie werden de apparaten subcutaan geïmplanteerd in de athymische mannelijke muizen van 4-6 weken oud met behulp van steriele chirurgische procedures en algehele anesthesie (4).
Resultaten
Hoewel de experimentele set-up van deze procedure conceptueel simplistisch was, leverden de resultaten een onschatbaar inzicht op in het idee van engineering weefsel voor regeneratie door middel van 3D-steigers. Na 6 weken in vivo incubatie, vertoonde de controlegroep geen spoor van kraakbeenvorming. Na verwijdering van de stent, behield de huid van de muizen zijn oorspronkelijke uitzicht en werd het polymeer geresorbeerd zoals verwacht. De meest significante resultaten hadden echter betrekking op de verschillen die werden waargenomen in de experimentele groepen I en II. Na 3-4 weken in vivo incubatie werden verschillen in de vorm van het oor duidelijk. Exemplaren van experimentele groep I hebben een morfologie die bijna identiek is aan die van het implantaat, dat na 4 weken goed gevestigd was en gehandhaafd bleef gedurende de extra 8 weken na verwijdering van de stent (zie figuur _). In tegenstelling, de muizen van experimentele groep II ontwikkelde een oor dat slechts ongeveer overeenkwam met die van het polymeer steiger als het was verkleind en distoreted in vorm zoals blijkt uit figuur _ (4).
De sociale reactie
Hoewel deze doorbraak voor de wetenschappelijke gemeenschap en de pioniers van weefselmanipulatie monumentaal en opwindend was en tal van wegen voor onderzoek opende en waardevolle wetenschappelijke vragen opriep, had zij een even sterke reactie op de wetenschappelijke gemeenschap. Na de publicatie van Vacanti’s artikel in augustus 1997 werd een sterke verontwaardiging geuit door de anti-genetica groep en dierenrechtenactivisten. Deze ongunstige sociale reactie werd in de hand gewerkt door een film van BBC’s Tomorrow’s World, alsook door een advertentie die in de New York Times werd geplaatst door de groep die het Turning Point Project wordt genoemd (zie figuur 6).
In de advertentie werd de afbeelding van Vacanti’s muis getoond met een misleidende kapitein die verklaarde: “Dit is een echte foto van een genetisch gemanipuleerde muis met een menselijk oor op zijn rug.” Deze verklaring impliceerde dat de wetenschappers het genoom van de muis hadden gewijzigd door segmenten van menselijk DNA in te brengen. De sterke reactie die door de sociale groepen werd opgewekt, duurt tot op de dag van vandaag voort en enkele van de klassieke bijschriften uit het artikel zijn hieronder opgesomd om een beter begrip te helpen kweken van hoe de sociale gemeenschap tegen deze wetenschappelijke vooruitgang aankeek (5):
“Vindt iemand het daarom schokkend dat deze opkomende biotechnologie-industrie het in orde vindt om het evolutieproces vast te leggen en het leven op aarde een nieuwe vorm te geven die past bij haar balansen?”
Tot nu toe bestaan er nog geen half-mens, half-dier “chimaeren” (zoals zeemeerminnen of centauren), maar misschien krijgen we die binnenkort wel”
“Biotech-bedrijven verwijderen zonder blikken of blozen onderdelen van mensen (en andere wezens) en behandelen ons allemaal als auto-onderdelen op een ruilbeurs.”
“Ooit, als een van deze bedrijven eindelijk besluit dat de publieke stemming ontvankelijk is, zullen ze dan een mens-gorilla combo maken om het zware werk op zich te nemen?”
“Hebben we ons verstand verloren? (5)
(1) Atala, Anthony, en David J. Mooney. Synthetic Biodegradable Polymer Scaffolds. Boston: Birkhäuser, 1997. Gedrukt.
(2) Vacanti, Joseph. “Tissue Engineering and Regenerative Medicine.” Lezing. De Jayne Lezing. Amphilsoc. Web.
(3)D’Agnese, Joseph. “Broeders met een hart.” Discover juli 2001. Discover Magazine. 1 juli 2001. Web.
(4)Cao, Yilin, Joseph P. Vacanti, Keith T. Paige, Joseph Upton, and Charles A. Vacanti. “Transplantation of Chondrocytes Utilizing a Polymer-Cell Construct to Produce Tissue-Engineered Cartilage in the Shape of a Human Ear. Plastische en Reconstructieve Chirurgie 100.2 (1997): 297-302. Print.
(5)Rouse, Roger. “Who plays God in the 21st Century?” New York Times 25 mei 2001, 9e ed., sec. 62. Print.