Staging van de oestrische cyclus en inductie van oestrus bij experimentele knaagdieren: een update

Het belang van proefdieren in onderwijs en onderzoek kan niet genoeg worden benadrukt. Studies waarbij gebruik wordt gemaakt van diermodellen hebben voordelen, zoals de beschikbaarheid van proefpersonen, de mogelijkheid om invasieve tests uit te voeren, uitgebreide weefselmonsters te nemen, en standaardisatie van de ernst van de ziekte en de mogelijkheid van profylaxe . Andere voordelen zijn een veilige behandeling van de proefpersonen, geen uitval (behalve in geval van sterfte), en gecontroleerde proefomstandigheden. Hoewel de keuze van een dier in biomedisch onderzoek voor een bepaald onderzoek controversieel kan zijn en zeer omstreden, worden gewoonlijk muizen, ratten en konijnen als proefdieren gebruikt. Kleine knaagdieren zoals muizen en ratten hebben de voorkeur boven grotere dieren zoals konijnen, honden, katten, varkens en apen.

Bij onderzoek naar de voortplantingsfunctie, vooral bij vrouwelijke dieren, worden muizen en ratten vaak gebruikt, mogelijk vanwege hun goed gekarakteriseerde oestrische cyclus en veilige hantering. De korte en precieze duur van de oestrische periode bij deze knaagdieren maakt hen ook zeer geschikt. De bepaling van de oestrische fase is van essentieel belang voor de selectie van een vrouwelijk dier dat zal paren met een mannelijke soortgenoot om tijdige bevruchting te bereiken of om de oestrische periode te volgen als een variabele die het onderzoek kan beïnvloeden. Beoordeling van de oestrische cyclus bij proefdieren is een nuttige maatstaf voor de integriteit van de hypothalamus-hypofyse-ovariumas en de functionerende reproductieve status van het vrouwelijke voortplantingssysteem . Het kan ook worden gebruikt om de effecten van geneesmiddelen en chemicaliën op de voortplantingsfunctie te onderzoeken, die vaak tot uiting komen in een verstoring van de typische morfologie, cytologie en histologie van voortplantingsorganen en in een wijziging van de duur van bepaalde fasen van de oestrische cyclus.

De oestrische cyclus

De oestrische cyclus verwijst naar de voortplantingscyclus bij knaagdieren. Hij is vergelijkbaar met de menselijke voortplantingscyclus, die gewoonlijk de menstruatiecyclus wordt genoemd (eierstok- en baarmoedercyclus). De oestrische cyclus bestaat uit vier fasen, namelijk proestrus, oestrus, metestrus en diestrus, en duurt 4 tot 5 dagen (tabel 1). De voortplantingsperiode en de oestrische cyclus van muizen begint ongeveer de 26e dag na de geboorte met de opening van de vagina, dat is ongeveer 10 dagen voor de vaginale verhoorning. De apoptose-gemedieerde vaginale opening is een essentieel secundair kenmerk bij muizen, dat wordt gebruikt als voorspeller van puberteit . De vaginale ontplooiing gaat gepaard met een verhoging van de oestradiolconcentratie. Bij ratten vindt de vaginale opening plaats tijdens de eerste ovulatie .

Bij vrouwelijke ratten wordt de puberteit voorafgegaan door de pulsatiele afgifte van luteïniserend hormoon (LH) na de 4e postnatale week, ongeveer 30 dagen oud . Deze periode is de anestrus en treedt ongeveer 8 tot 9 dagen voor de eerste proestrus op. De eerste proestrus, oestrus, metestrus en diestrus volgen dan. Metestrus treedt alleen op als er geen bevruchting plaatsvindt.

Bij de mens daarentegen zijn er drie fasen van de menstruatiecyclus: de menstruatiecyclus, de proliferatieve (folliculaire) en de secretoire (luteale) fase. Deze cyclus begint in de puberteit. Gemiddeld duurt het ongeveer 28 dagen vanaf het begin van de ene menstruatie tot het begin van de volgende. Halverwege de cyclus, tussen de proliferatieve en de secretoire fase, bevindt zich de ovulatoire fase, waarin de eisprong plaatsvindt na de LH-piek. De proliferatieve fase wordt voornamelijk geassocieerd met hoge oestrogeenspiegels, terwijl de secretieve fase wordt geassocieerd met hoge progesteronspiegels.

De proestrusfase komt overeen met de menselijke folliculaire fase, die wordt geassocieerd met een stijging van de circulerende oestradiolconcentraties en een kleine stijging van prolactine, dit leidt tot een stijging van de afgifte van LH en follikelstimulerend hormoon (FSH). De piek in de FSH-concentratie met een daarmee gepaard gaande snelle daling van de oestradiolconcentratie correleert met de ovulatie en de oestrusfase. Metestrus en diestrus zijn homoloog aan de menselijke vroege en late secretiestadia van de voortplantingscyclus, respectievelijk, met hoge niveaus van progesteron.

Historisch perspectief

Het woord “oestrus” werd voor het eerst gebruikt door Heape . Dit is een Latijnse bewerking van het Griekse woord “oistros” dat “seksuele seizoen”, “horzel”, “razernij”, “steek” of “waanzin” betekent . Heape benoemde en definieerde verder de fasen van de oestrische cyclus bij zoogdieren in proestrus, metestrus, diestrus en anestrus. Proestrus is de voorbereidende fase voor het loops worden van een dier, metestrus is een korte periode die wordt gekenmerkt door de afname van de functies van het corpus luteum bij afwezigheid van conceptie, wanneer de activiteiten van de voortplantingsorganen geleidelijk afnemen, diestrus is een periode van korte rust tijdens het voortplantingsseizoen, en anestrus is een niet-broedende periode waarin de voortplantingsorganen tot rust komen. Gedragsveranderingen, evenals morfologische, cytologische en histologische veranderingen in het voortplantingskanaal, beschrijven deze fasen.

Vroeger werden macroscopische veranderingen in de vulva (zoals zwelling van de vulva), vaginale afscheidingen (zoals bloeding en slijm), en de baarmoeder (zoals verstopping) en microscopische veranderingen in het voortplantingskanaal gebruikt om oestrische cyclusfasen te definiëren. Macroscopische bevindingen waren echter onbetrouwbaar bij kleine knaagdieren, en histologische analyse was en blijft een invasieve procedure die niet geschikt is voor het bepalen van de oestrische cyclus bij levende dieren. Stockard en Papanicolaou karakteriseerden later de veranderingen van de vagina tijdens de oestrische cyclus door middel van histologie en cytologie; dit omzeilde de eerdere problemen van onbetrouwbaarheid en invasiviteit. In de loop van de tijd hebben verschillende studies de beoordeling van Stockard en Papanicolaou goedgekeurd; dit heeft geleid tot de bestaande definities van de fasen van de oestrische cyclus. Het Pap-uitstrijkje van Papanicolaou wordt vandaag de dag nog steeds gebruikt als screening op baarmoederhalskanker.

Technieken voor de beoordeling van de oestrische cyclus

In verschillende studies zijn verschillende methoden voorgesteld om de oestrische cyclus te beoordelen op basis van de veranderingen in de fysiologie en de anatomie van het dier. Deze methoden omvatten visuele beoordeling, vaginale cytologie, histologisch onderzoek van de voortplantingsorganen, vaginale wand impedantie, en urine biochemie.

Visuele beoordeling

De visuele methode van het evalueren van de oestrische cyclus is algemeen aanvaard. Het is niet-invasief, eenvoudig, goedkoop, snel, minder belastend voor dieren en onderzoekers, en kan overal en op elk moment worden uitgevoerd, mits de verlichting voldoende is. Deze methode is even nauwkeurig en betrouwbaar als de vaginale uitstrijk. Naar verluidt is het de snelste methode om de oestrusfase te bepalen. In de meeste studies waarin deze methode werd toegepast, werden echter muizen gebruikt; dit zou erop kunnen wijzen dat deze techniek meer geschikt is voor kleine dieren zoals muizen en ratten. De resultaten van deze techniek zijn ook afhankelijk van de waarnemer.

Bij de visuele beoordeling van de oestrische fase moet de muis in de niet-dominante hand worden gehouden en met de voorpoten rustend op een oppervlak in bedwang worden gehouden; til de staart voorzichtig op en onderzoek en beoordeel vervolgens de vulva aan de hand van de criteria van Champlin et al. Een digitale foto voor documentatie is essentieel. Het is ook belangrijk overhaaste onderzoeken te vermijden om verkeerde interpretaties te voorkomen.

Het uiterlijk van de vagina in verschillende fasen van de oestruscyclus is samengevat in tabel 2. In de proestrus fase lijkt de vaginaopening vol, gezwollen en vochtig. De weefsels zijn roze, met strepen in zowel de dorsale als de ventrale lippen van de vulva. In oestrus lijkt de vagina op die in de proestrus, maar ze is minder roze, minder gezwollen en minder vochtig met meer opvallende strepen. In de metestrus is de vaginaopening bleek en droog met een laagje wit celresten. De kenmerken van diestrus omvatten een zeer vochtige vaginaopening, die soms te klein is en bij sommige muizen gesloten is zonder weefselzwelling (Fig. 1, 2 en 3).

Vaginale uitstrijkjes/cytologie

Gelijkaardig aan de visuele beoordeling is ook de vaginale cytologie algemeen aanvaard. Het lijkt de meest gebruikte techniek te zijn om de fasen van de oestrische cyclus vast te stellen. Het is niet-invasief en betrekkelijk goedkoop. Hoewel deze methode enige vaardigheid vereist voor microscopisch onderzoek van de vaginale afscheidingscellen, is zij nauwkeurig en betrouwbaar. Deze methode is echter ook omslachtig en tijdrovend gebleken.

Tijdens de evaluatie worden het dier en zijn voorpoten in bedwang gehouden. De staart wordt opgetild om de vagina zichtbaar te maken. De vaginale cellen worden gespoeld door het voorzichtig inbrengen van een kleine hoeveelheid (100 pi) gedestilleerd water of zoutoplossing met behulp van een pipet of steriele latex bol. Fosfaatgebufferde zoutoplossing kan een alternatieve vloeistof zijn. Laat de vloeistof langzaam in het vaginale gebied stromen en zuig het terug in het uiteinde; dit moet ongeveer 4 tot 5 keer worden herhaald in dezelfde steriele latexballon. Het is van essentieel belang dat de pipet of de steriele latexballon aan de ingang van het vaginale kanaal wordt geplaatst en niet in de vaginale opening doordringt. De vloeistof met enkele druppels celsuspensie wordt daarna op een glasplaatje gebracht, aan de lucht gedroogd en dienovereenkomstig gekleurd. Er kan een 0,1% kristalvioletkleuring (0,1 g kristalvioletpoeder in 100 ml dubbel gedestilleerd water) worden gebruikt. Alternatieve kleurstoffen zijn Romanowsky-kleurstoffen (zoals gemodificeerd Wright’s, Wright’s Giemsa) en Toluidine blauw O . Het glaasje moet vervolgens worden bedekt met een dekglaasje en onmiddellijk onder een lichtmicroscoop worden onderzocht bij een vergroting van 200 X.

Als alternatief kan een vaginaal uitstrijkje worden verkregen met een wattenstaafje dat is bevochtigd met fysiologische zoutoplossing op kamertemperatuur en in de vagina van de gefixeerde muis wordt gebracht. Het wattenstaafje moet voorzichtig tegen de vaginale wand worden gedraaid en gerold en vervolgens worden verwijderd. De verzamelde cellen worden vervolgens overgebracht op een droog glaasje door het wattenstaafje over het glaasje te bewegen. Het glaasje wordt aan de lucht gedroogd, gekleurd en onder de microscoop bekeken.

De vaginale afscheiding bestaat uit drie soorten cellen. Het gaat om leukocyten, verhoornde epitheelcellen en gekernde epitheelcellen. Schatting van de fase van de oestrische cyclus is gebaseerd op het aandeel van deze cellen in de vaginale afscheiding (tabel 3 en fig. 4).

De proestrusfase wordt gekenmerkt door talrijke ronde cellen met een kern die uniform van grootte en uiterlijk zijn. Ze verschijnen in clusters of individueel. Er zijn ook enkele verhoornde epitheelcellen met anuclei. In de vroege proestrus kunnen enkele witte bloedcellen in de vrouw aanwezig zijn (Fig. 5). In de oestrusfase zijn er overvloedig geanucleerde verhoornde epitheelcellen. Het cytoplasma is korrelig en de cellen zijn onregelmatig van vorm. Ook worden talrijke bacteriën en soms gekernde epitheelcellen waargenomen (Fig. 6 en 7). In de metestrus wordt een groot aantal leukocyten en een klein aantal grote, niet-granulaire en anucleaire verhoornde epitheelcellen gezien. De vorming van corpus luteum, dat er niet in slaagt volledig te luteïniseren door gebrek aan progesteron en resulteert in het afslijten van het baarmoederslijmvlies, verklaart de verhoornde epitheelcellen en polymorfonucleaire leukocyten die in vaginale swabs aanwezig zijn. In de late metestrus kunnen ook enkele gekernde epitheelcellen aanwezig zijn (fig. 8 en 9). Diestrus vertoont prominente polymorfonucleaire leukocyten en enkele epitheliale en verhoornde cellen. Leukocyten blijven het overheersende celtype na verwijdering van celresten (fig. 10).

Histologisch onderzoek van de voortplantingsorganen

Hoewel de bepaling van de fasen van de oestrische cyclus door deze techniek zeer betrouwbaar en nauwkeurig is, heeft zij vele nadelen. Deze techniek is invasief en niet bruikbaar voor oestrische bepaling bij levende laboratoriumdieren. Het is ook duur en vereist een hoge mate van vaardigheid. Bovendien is zij te omslachtig en tijdrovend. Deze methode is niet gemakkelijk beschikbaar, dus niet haalbaar, vooral in afgelegen gebieden van de tropische regio.

Het minimale vereiste voor oestrische cyclus evaluatie door histologie is de volledige longitudinale secties van de vagina en baarmoederhals, transversale secties van het midden-portie van beide baarmoeder hoorns, en midden secties van beide eierstokken . De aanwezigheid van ovariële follikels kan niet worden gebruikt om de fase van de oestrische periode te bepalen bij ratten en muizen met korte oestrische cycli. Follikels zijn bijna altijd in alle stadia in de eierstokken aanwezig. Het verschijnen van bepaalde morfologieën van het corpus luteum kan echter helpen bij de stadiëring, hoewel dit niet definitief is. De uitgesneden organen worden gefixeerd met 10% formaline, gekleurd met hematoxyline en eosine, en microscopisch onderzocht.

Histologische verschijnselen van de voortplantingsorganen in verschillende oestrische fasen zijn weergegeven in tabel 4 en de figuren 11, 12, 13 en 14.

Vaginale wandimpedantie

Hoewel het gebruik van elektrische impedantie op de vaginale wand om de oestrische fase te bepalen controversieel is en zelden in de literatuur wordt geciteerd, lijkt het steeds meer aandacht te krijgen. Deze methode is handig, gemakkelijk verkrijgbaar en vereist minder vaardigheid. Zij is veel minder vatbaar voor subjectieve interpretatie van de kant van de technische operator dan de meer conventionele vaginale uitstrijkjesmethode. Zij is echter ook duur en wordt niet algemeen aanvaard, mogelijk wegens haar onbetrouwbaarheid. Met deze techniek kan een onderscheid worden gemaakt tussen bronstige en niet bronstige dieren.

Een impedantiemeter die voor deze techniek wordt gebruikt, bestaat uit een meter en een vaginale sonde (fig. 15). Een persoon houdt het dier in bedwang terwijl een andere persoon de vaginale sonde gedurende ongeveer 30 s inbrengt om impedantiemetingen te verrichten op het scherm van de meter. De sonde wordt vóór elke analyse schoongemaakt met alcohol 70%. Als alternatief kan een eenvoudige, goedkope en draagbare elektrische meter op batterijen worden gebruikt die de weerstand over een groot bereik meet en die gewoonlijk door elektriciens wordt gebruikt, zoals beschreven door Ramos e.a. Bij gebruik van dit alternatieve apparaat moeten er draden aan worden bevestigd die zijn gemaakt van de interne bedrading van een typische goedkope afgeschermde audiokabel, en moet er een mannelijke aansluiting als vaginale sonde worden gebruikt (fig. 16).

Dieren in oestrusfase hebben een hogere vaginale impedantie dan dieren in de non-estrusfase. Jaramillo et al. toonden aan dat het paren van een vrouwtje met een mannelijk dier op basis van de vaginale wandimpedantie resulteerde in een hoger percentage bevestigde paringen en zwangerschappen in vergelijking met het paren op basis van het vaginale uitstrijkje. Anderzijds stelden Singletary et al. vast dat ratten in oestrusfase, zoals bepaald door vaginale cytologie, een hogere vaginale impedantie hadden dan die in nietoestrusfase, maar vaginale impedantie en oestruscyclusfase, zoals bepaald door vaginale cytologie, correleerden niet. De meeste auteurs die het gebruik van vaginale wandimpedantie hebben gedocumenteerd, verifieerden hun bevindingen met vaginale cytologie; vandaar dat er geen referentiewaarde is gerapporteerd om aan te geven of een dier al dan niet in oestrus is.

Uriene biochemie

Hoewel deze methode om oestrus te beoordelen nog aan populariteit en universele aanvaarding moet winnen, is het een nuttig hulpmiddel. Deze techniek is eenvoudig, betrekkelijk goedkoop en niet omslachtig. Aangezien het gehalte aan koolhydraten, eiwitten en vetzuren in de urine gewoonlijk een reactie is op oestradiol en progesteron, kan dit per soort en stam verschillen. Deze methode is niet-specifiek en onbetrouwbaar omdat sommige dieren een constant hoog eiwitgehalte in hun urine hebben, dat bij deze dieren als chemisch signaal fungeert.

Tijdens de beoordeling moet het proefdier boven een horlogeglas worden gehouden en moet een zachte massage van de buik worden toegepast om de mictie te stimuleren. Het urinemonster wordt verzameld en op het moment van de verzameling door een kaasdoek of nylon gaas (16-120 μm) gezeefd. Het monster moet bij – 20 °C worden bewaard als het niet onmiddellijk wordt geanalyseerd. Urine koolhydraten, eiwitten, en lipiden/vetzuren moeten worden geanalyseerd met behulp van standaardmethoden.

Het eiwit- en lipidengehalte in de urine is aanzienlijk hoger in de proestrus- en oestrusfase. De concentratie vetzuren in de urine is ook zeer hoger in oestrus. Het koolhydraatgehalte in de urine is gedurende de gehele oestruscyclus vergelijkbaar. Net als de vaginale wandimpedantie zijn er geen standaardwaarden voor de biochemische urine in elke fase van de oestrische cyclus voor algemeen gebruikte proefdieren.

Inductie van oestrus

Bij het beoordelen van seksueel gedrag, vooral bij mannelijke dieren, of van de lustopwekkende werking van een bepaald middel/drug, is het van essentieel belang de vrouwelijke dieren kunstmatig oestrus(fase)/warmte op te wekken. Dit verhoogt hun ontvankelijkheid en paringsbereidheid voor de mannelijke soortgenoten. Deze praktijk is gebruikelijk in de veehouderij. Dit wordt bereikt door toediening van een suspensie van ethinylestradiol à 100 μg/dier per orale toediening 48 uur vóór de paring met de mannelijke tegenpartij en progesteron à 1 mg/dier subcutaan 6 uur vóór de paring. Als alternatief worden oestradiolbenzoaat à 10 μg/100 g lichaamsgewicht en progesteron à 0,5 mg/100 g lichaamsgewicht respectievelijk 48 uur en 4-6 uur vóór de koppeling subcutaan toegediend (tabel 5). De estrusfase wordt meestal bevestigd door een vaginaal uitstrijkje. Een combinatie van visuele beoordeling met een vaginaal uitstrijkje kan de oestrische fase vaststellen. De oestrische fase van het geïnduceerde vrouwelijke dier wordt bevestigd door de beoordeling van de ontvankelijkheid. Dit gebeurt door hen vóór het experiment/de test bloot te stellen aan een mannelijke tegenhanger (niet gebruikt voor het onderzoek). Vrouwelijke dieren met een maximale ontvankelijkheid mogen paren.