Typetechnologieën met korte tandemherhalingen voor het testen van de identiteit van de mens

Inleiding

Korte tandemherhalingen (STR’s), die soms microsatellieten of simple sequence repeats (SSR’s) worden genoemd, zijn op een accordeon lijkende DNA-reeksen met kernrepeenheden van twee tot zeven nucleotiden lang die in tandem ongeveer een half dozijn tot enkele tientallen keren worden herhaald (1). Hoewel het menselijk genoom duizenden en duizenden STR-merkers bevat, is slechts een kleine kern van loci geselecteerd voor gebruik bij forensisch DNA-onderzoek en het testen van de menselijke identiteit (2). Net zoals het gebruik van één gemeenschappelijke munt in financiële zin, maken kernloci het mogelijk gelijkwaardige genetische informatie te delen en te vergelijken. Er zijn nu commerciële kits beschikbaar voor het genereren van DNA-profielen die deze core STR-loci bevatten (tabel 1). Elk jaar worden wereldwijd miljoenen STR-profielen gegenereerd door overheids-, universiteits- en particuliere laboratoria die verschillende vormen van menselijke identiteitstests uitvoeren, waaronder DNA-databanken, forensische zaken, identificatie van vermiste personen/massarampen of afstammingsonderzoek.

Tabel 1. Kenmerken van de 15 STR Loci aanwezig in de commercieel verkrijgbare Kit AmpFlSTR Identifiler

Bij STR-typering wordt PCR gebruikt om informatie te winnen uit kleine hoeveelheden beschikbaar biologisch materiaal. De relatief korte PCR-productgroottes van ongeveer 100-500 bp die met STR-testen worden gegenereerd, zijn over het algemeen compatibel met aangetast DNA dat aanwezig kan zijn als gevolg van omgevingsinvloeden op het biologisch bewijsmateriaal dat op een plaats delict is aangetroffen. PCR-amplificatie van meerdere STR-loci tegelijk, of multiplexing, is mogelijk met verschillend gekleurde fluorescerende kleurstoffen en PCR-producten van verschillende grootte. Het gebruik van meerdere loci maakt een hoog onderscheidingsvermogen in één test mogelijk zonder dat veel DNA wordt verbruikt (bv. 1 ng of minder uitgangsmateriaal). Het is vermeldenswaard dat deze STR-kernloci voorkomen tussen genen waarin een hoge mate van variabiliteit wordt getolereerd en dus niet direct verantwoordelijk zijn voor fysieke kenmerken zoals haarkleur of oogkleur of genetische ziekten.

Commerciële kits

Commercieel verkrijgbare kits met voorgemengde primers en een standaard mastermengsel met polymerase, enzymbuffers en dNTP’s vereenvoudigen het genereren van STR-profielen en leveren resultaten voor een uniforme set STR-kernloci, zodat DNA-profielen van misdadigers nationaal en internationaal kunnen worden uitgewisseld. In de meeste forensische laboratoria wordt de voorkeur gegeven aan in de handel verkrijgbare kits boven eigen tests, ook al zijn deze duurder, omdat deze kits de procedures helpen vereenvoudigen en standaardiseren en de druk bezette eindgebruiker niet langer belasten met de kwaliteitscontrole van de PCR-componenten. Bovendien leveren STR-kits allel-ladders met veel voorkomende STR-allelen waarvan het aantal herhalingseenheden vooraf via DNA-sequencing is gekarakteriseerd. Deze allel-ladders worden gebruikt om de PCR-productgrootte te kalibreren aan het aantal STR-repeereenheden voor genotyperingsdoeleinden. Figuur 1 toont de allel-ladder voor de veelgebruikte AmpFlSTR Identifiler-kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) (3) met 205 allelen over 16 gecoamplificeerde loci-15 STR’s plus een amelogenine geslachtstypebepaling.

Het volledige proces voor STR-typering omvat monstername, DNA-extractie, DNA-kwantificering, PCR-amplificatie van meerdere STR-loci, STR-allelscheiding en -dimensionering, STR-typering en profielinterpretatie, en een rapport over de statistische significantie van een overeenkomst (indien waargenomen). In veel gevallen, zoals bij aanranding, kunnen DNA-mengsels het resultaat zijn van een combinatie van lichaamsvloeistoffen van het slachtoffer en de dader.

DNA-scheidingen

Na de PCR-amplificatie wordt de totale lengte van het STR-amplicon gemeten om het aantal herhalingen te bepalen in elk allel dat in het DNA-profiel wordt aangetroffen. Deze lengtemeting wordt verricht via een scheiding op basis van grootte met behulp van gel of capillaire elektroforese (CE). Elk STR-amplicon is tijdens de PCR fluorescent gelabeld, aangezien de voorwaartse of achterwaartse locus-specifieke primer een fluorescerende kleurstof bevat. Door de kleur van de kleurstof en de migratieduur van elk DNA-fragment ten opzichte van een interne standaard te registreren, kan dus de grootte van elk STR-allel worden bepaald nadat het van andere STR-allelen is gescheiden. Veelgebruikte instrumenten voor het scheiden van STR-allelen en het bepalen van de grootte zijn de ABI PRISM 310 en ABI PRISM 3100 genetische analyzers (Applied Biosystems) (4).

Er zijn een aantal zowel biologische als instrumentele artefacten die vaak moeten worden uitgezocht om een volledig en nauwkeurig STR-profiel te genereren (5; zie ook referentie 1, hoofdstukken 6 en 15). Biologische artefacten zijn onder meer stotterproducten, gesplitste pieken door onvolledige adenylering, triallelpatronen en variante-allelen met mutaties in de repeat of flankerende regio’s waardoor een allel off-ladder is. Instrumentele artefacten ontstaan door spanningspieken, kleurstofblobs en doorschijnen tussen kleurstofkleuren.

Terwijl multikleuren fluorescentiedetectie CE-instrumenten, zoals de ABI PRISM 3100 genetic analyzer, momenteel het veld domineren, wordt gewerkt aan de ontwikkeling van microchip CE-platforms (6) voor het uitvoeren van DNA-scheidingen met hoge resolutie met uiteindelijke integratie van de PCR-amplificatie en CE-scheidingen (7). Bovendien zijn massaspectrometrie- (MS) met MALDI- (matrix-assisted laser desorption/ionization) en ESI- (electrospray ionization) technieken gebruikt voor STR-typering zonder allelische ladders (8,9).

miniSTRs: Recovery of Information From Degraded DNA

DNA-moleculen die aan water en/of warmte worden blootgesteld, zullen na verloop van tijd in kleinere stukjes uiteenvallen. Uit een aantal studies is gebleken wat theoretisch voorspeld wordt, namelijk dat DNA-types doeltreffender uit afgebroken DNA-monsters kunnen worden teruggewonnen wanneer de PCR-producten kleiner zijn (10-12). Door de PCR-primers dichter bij het STR-repeatgebied te plaatsen, kan de productgrootte worden verkleind met behoud van dezelfde informatie (11). De bruikbaarheid van miniSTR-tests is bevestigd in intra- en interlaboratoriumstudies met aangetaste botmonsters en verouderde bloed- en speekselvlekken (12). De succespercentages bij het terugwinnen van informatie uit aangetaste DNA-monsters verbeteren met miniSTR-systemen in vergelijking met conventionele STR-kits. Een tijdlijn voor de ontwikkeling van miniSTRs is te vinden op www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/miniSTR/timeline.htm.

Met gebruikmaking van hun 5-dye chemie en mobiliteitsmodificatietechnologie heeft Applied Biosystems een miniSTR-kit ontwikkeld waarmee acht core STR-loci en amelogenine kunnen worden geamplificeerd met een kleinere PCR-productgrootte dan met de huidige commerciële kits. Deze AmpFlSTR MiniFiler-kit, die een verbeterd PCR-mastermengsel bevat, moet helpen bij de inspanningen om resultaten van gedegradeerde DNA-monsters terug te krijgen. Het is echter belangrijk in gedachten te houden dat, omdat bij de miniSTR-kit andere PCR-primers worden gebruikt dan bij eerdere STR-kits, er discordante resultaten kunnen optreden als gevolg van primerbindingsplaatsmutaties die alleluitval veroorzaken.

Concordantietests

Sommige STR-allelen bevatten sequentievariatie in de flankerende regio’s. Als een nucleotideverandering (of insertie of deletie) optreedt in een PCR-primerbindingsplaats in een bepaald allel, is het mogelijk dat de gemuteerde sequentie incompatibel is met de annealing van de primer en dat het allelvariant niet amplificeert (1). Deze uitval van het allel wordt ook wel een null-allel genoemd. Een monster dat eigenlijk een heterozygoot is, kan als een schijnbare homozygoot tevoorschijn komen als de PCR-primers er niet in slagen het allel dat de puntmutatie bevat te annealiseren en te amplificeren (figuur 2). In sommige gevallen kan het nulde allel worden teruggevonden door de annealingtemperatuur te verlagen, waardoor een minder stringente binding tussen de primer en het DNA-sjabloon mogelijk wordt. Een concordantiestudie, waarbij een reeks van dezelfde DNA-monsters met niet-overlappende PCR-primers wordt getest, maakt detectie van nulde allelen mogelijk. Bij een onderzoek van MiniFiler versus Identifiler werden slechts 27 discrepanties gevonden in meer dan 10.000 vergeleken genotypes (13). Een samenvatting van discordante resultaten die in concordantiestudies zijn waargenomen, is beschikbaar op www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/NullAlleles.htm.

Zolang dezelfde PCR-primers worden gebruikt, kunnen identieke STR-typeringsresultaten worden verwacht op hetzelfde DNA-monster. Als de primerposities echter worden gewijzigd, bestaat de mogelijkheid van allel drop-out of grootteverschuiving. In sommige gevallen kunnen extra primers die overeenkomen met het gemuteerde allel – vaak degenerate primers genoemd – in het primermengsel van de kit worden opgenomen om herstel van PCR-amplificatie mogelijk te maken wanneer het variant-allel met een mismatch in de primerbindingsplaats aanwezig is (14).

Perspectieven voor de toekomst

Zoals bijna 7 jaar geleden werd opgemerkt door de Werkgroep Onderzoek en Ontwikkeling van de Nationale Commissie voor de toekomst van DNA-bewijs (15), zullen STR’s in de nabije toekomst waarschijnlijk de favoriete merkers blijven, omdat zij op grote schaal worden gebruikt in nationale DNA-databanken (2,16,17). We zullen waarschijnlijk te maken krijgen met evolutionaire vooruitgang in de typeringstechnologie, snellere amplificatiemethoden, extra STR-kits die nieuwe loci bevatten, en computerprogramma’s die een snelle evaluatie van STR-typeringsgegevens mogelijk maken. Door voortdurende vooruitgang kunnen STR-typeringstechnologieën worden geminiaturiseerd en worden geïntegreerd met andere onderdelen van het proces, zoals DNA-extractie en amplificatie. Er worden doeltreffende DNA-databanken aangelegd en talrijke forensische zaken worden vandaag opgelost door het genereren van STR-profielen met een gemeenschappelijke reeks genetische markers. Deze huidige core loci hebben een vitale rol gespeeld bij het testen van de identiteit van mensen en zullen dat ook in de toekomst blijven doen.