Charles Mayo nasceu em Rochester, Minnesota, a 19 de Julho de 1865, filho de William Worrall Mayo, natural de Inglaterra e médico generalista que se tinha estabelecido no território de Minnesota em 1855.
O jovem rapaz acompanhou o seu pai e o irmão mais velho, William J. Mayo, em inúmeras viagens, tanto na aldeia como no campo, enquanto o pai viajava para os seus pacientes. Em várias ocasiões administrou éter aos pacientes antes de obter o seu diploma em medicina.
Charles Mayo estudou nas escolas públicas de Rochester, e recebeu o grau de Doutor em Medicina da Universidade Northwestern em 1888. Quando Mayo estava em casa há cerca de um ano, ajudando o seu pai e irmão mais velho na sua prática de medicina geral, as irmãs de S. Francisco fundaram o Hospital St. Mary’s em Rochester. Carlos era um dos três do pessoal do novo hospital, sendo os outros dois o seu pai e o seu irmão mais velho. Nos últimos anos, o irmão mais velho recordou: “O Charlie depressa me fez ser um cirurgião melhor, e comecei a especializar-me no trabalho abdominal e nas operações aos ureteres e rins”. Conseguia dominar uma situação difícil com uma rapidez excepcional, e tinha uma facilidade numa variedade de problemas cirúrgicos desafiantes que logo o encontraram a realizar procedimentos tão diferentes como a excisão de uma articulação do joelho, a secção do gânglio gasseriano, e a histerectomia. Também adquiriu um elevado grau de habilidade nas operações ao olho, cabeça e pescoço, enquanto o seu irmão se concentrava nas operações abdominais.
Dedicou-se à prática muito extensa que ele e o seu irmão continuaram juntos, depois de o seu pai se ter reformado da prática activa por volta de 1890. Os dois irmãos alistaram a ajuda de um terceiro médico em 1892, outro em 1901, e muitos outros como a clínica fundada pelo seu pai em 1863 tornou-se bem conhecida no sul do Minnesota, e depois em todo o estado.
Por 1903 o nome Clínica Mayo era conhecido não só por pessoas que procuravam os serviços dos irmãos e dos seus associados, mas também por outros médicos fora do pequeno grupo de médicos em Rochester. Em 1915, Charles e o seu irmão fundaram a Fundação Mayo para o Ensino e Investigação Médica como parte da Escola de Graduação da Universidade de Minnesota, com bolsas de estudo em várias especialidades. Os Mayos tornaram-se professores famosos e foram considerados com profundo afecto e respeito pelas centenas de jovens cirurgiões que trabalharam com eles.
Este trabalho clássico dá uma perspectiva fascinante do estado da cirurgia do cólon e rectal na viragem do século. Nele Mayo sugere a conveniência da abordagem combinada sincrónica “se o cirurgião tiver um bom assistente”. Acredita-se ser ele o primeiro a recomendar esta manobra.
Honros de todas as descrições foram conferidas a Charles Mayo, tal como o foram ao seu irmão mais velho. Foi eleito presidente da Associação Cirúrgica Ocidental, da Sociedade de Cirurgia Clínica, do Congresso Clínico de Cirurgiões da América do Norte, da Associação Médica Americana, do Colégio Americano de Cirurgiões, e da Associação Cirúrgica Americana.
Morreu em Chicago, onde contraiu penumonia durante uma visita, a 26 de Maio de 1939, aos 73 anos de idade. A morte do seu irmão seguiu-se dois meses mais tarde.