br>>>/p>h2>The Novel Approach to Tissue Regeneration
Um dos momentos mais críticos no campo da engenharia de tecidos ocorreu na cidade de Boston em 1954, num projecto dirigido pelo Dr. Joseph Murray. Sob o seu controlo, uma equipa de médicos realizou com sucesso o primeiro transplante de órgãos sólidos. Neste caso, um rim foi transplantado de um gémeo idêntico ao seu irmão gravemente doente. Este evento estimulou um amplo movimento de investigação onde cientistas e laboratórios iniciaram um extenso trabalho nos campos da biologia de transplantes, imunologia, e outras disciplinas relacionadas. Juntamente com este esforço de investigação vieram avanços significativos no desenvolvimento de técnicas cirúrgicas e nas tentativas de melhorar a supressão imunitária do hospedeiro. Contudo, mesmo décadas mais tarde, muitos desafios subsistem entre os transplantes de tecidos e o sucesso clínico. Alguns destes desafios incluem as despesas associadas ao procedimento de transplante real, os cuidados de trabalho intensivo necessários, e a elevada possibilidade de rejeição do hospedeiro. Ainda hoje, o problema principal reside na questão fundamental da escassez de órgãos e dadores (1).
A maioria dos laboratórios de investigação até aos anos 80 centravam a sua atenção em formas de combater o “problema imunitário” para melhorar a tecnologia de transplante de órgãos, e os desenvolvimentos estavam a ser feitos com o uso de xenoenoganatos e dispositivos de suporte de bio-híbridos. Só em meados da década de 1980 é que Joseph Vacanti, MD do Hospital Infantil de Boston, se juntou ao Dr. Robert Langer do departamento de ciência de polímeros do MIT, que a ideia de realmente conceber tecidos funcionais para utilização em transplantes se tornou uma solução potencial para combater o problema da escassez de órgãos. Juntos, o seu trabalho viria a redefinir o campo da engenharia de tecidos (1).
h2> A “Visão”
O Conceito
Vacanti e Langer previram o desenvolvimento de um sistema capaz de gerar novas e naturais substituições permanentes de tecidos através da utilização de matrizes sintéticas 3D biodegradáveis semeadas com células parenquimatosas. Conceitualmente, esta ideia teve muitas das respostas para os problemas actuais associados à substituição de tecidos. Idealmente, o andaime de polímero poderia ser concebido para promover a proliferação e diferenciação celular, permitir o crescimento vascular, degradar-se de forma controlável, e reabsorver completamente in vivo, deixando apenas o tecido recém-formado. Se bem sucedido, o desenvolvimento e implementação deste dispositivo poderia proporcionar várias vantagens sobre os métodos tradicionais, uma vez que o andaime poderia ser potencialmente manipulado para permitir um maior controlo sobre a libertação de hormonas e factores de crescimento essenciais à funcionalidade celular, a fixação das células à matriz antes da introdução no corpo poderia aumentar o número de células capazes de serem implantadas, o molde poderia ser estruturado em várias formas, e este método poderia permitir transplantes autólogos ou alogénicos (1).
Dados preliminares e provas de apoio
Na prossecução dos seus esforços de investigação, os irmãos Vacanti e Langer basearam o seu trabalho em várias observações fundamentais que foram recolhidas em estudos preliminares. Em primeiro lugar, todos os organismos estão continuamente a experimentar os processos de renovação, remodelação, e substituição das suas células. Em segundo lugar, as células que estão dissociadas do seu ambiente natural são capazes de reformar estruturas quando adequadamente sinalizadas pelo seu ambiente circundante para o fazer. Em terceiro lugar, as células parenquimatosas de órgãos são dependentes da matriz celular e desempenham papéis essenciais na forma celular, divisão e diferenciação. Além disso, estudos anteriores demonstraram que 2-3mm3 é o maior volume de tecido que pode ser implantado que permite uma nutrição adequada, troca de gases, etc., até que ocorra a angiogénese. Com estas observações biológicas em mente, os irmãos Vacanti e Langer propuseram-se conceber um novo andaime de polímero 3D que poderia ser carregado com células de órgãos paranquimatosos em cultura e depois implantado num hospedeiro (1).
>h2>A Matriz Ideal
Uma das considerações centrais na concepção deste andaime de polímero para a engenharia de tecidos de substituição é em relação à selecção de um material de matriz apropriado. Este material ideal de andaime teria de ter várias características essenciais e capacidades de afinação para uma funcionalidade adequada nesta aplicação, pois tem de ser – biocompatível, mecanicamente estável, flexível, controladamente degradável, reabsorvível, e capaz de fazer interacções químicas específicas com as células semeadas. Em termos de biocompatibilidade, é essencial que o polímero evite provocar uma resposta imunitária indesejável no hospedeiro que poderia resultar, em última análise, em rejeição imunitária e falha processual. Fisicamente, a matriz precisa de ter um certo grau de estabilidade mecânica e flexibilidade para garantir que possa fornecer o apoio e espaço necessários para a formação de tecidos, para que possa ser facilmente concebida e construída em formas e estrutura variáveis, e deve ser capaz de resistir ao procedimento e ao ambiente in vivo, a fim de manter esta estrutura após a implantação. Finalmente, algumas capacidades de afinação desejáveis do andaime polímero ideal implicariam características de degradação sintonizáveis, a matriz deveria ser capaz de reabsorver para o corpo, deixando apenas tecido natural e funcional, e a manipulação da química de superfície para ditar as interacções desejadas entre as células semeadas e a superfície da matriz (1).
Os irmãos Vacanti e Langer determinaram que os polímeros do grupo dos poliésteres e das famílias de ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, e os seus copolímeros eram os melhores candidatos para o seu material de andaime. Estes polímeros não eram apenas biocompatíveis, estáveis e flexíveis, mas também podiam ser degradados pela hidrólise ao dióxido de carbono e produtos de água e a taxa de reabsorção do polímero podia ser concebida para variar de uma escala temporal de meses a anos, dependendo da proporção de monómeros de polímeros utilizados (1).
br>>>h2>Passos para a Realidade
Os anos que se seguiram ao emparelhamento Vacanti-Langer em 1985 caracterizaram-se por experiências e desenvolvimentos rápidos no campo da engenharia de tecidos para elucidar a viabilidade do dispositivo de andaime previsto para a regeneração de tecidos.
Uma das experiências iniciais realizadas utilizou um pequeno disco de polianidrido no qual os hepatócitos foram semeados numa monocamada na bolacha e implantados no animal (ver Figura 3). A análise revelou que o número de células e a densidade não eram suficientes para uma gravação bem sucedida (1). Contudo, esta experiência levou à realização de um constrangimento fundamental. Todas as células requerem a troca adequada de oxigénio e nutrição com o ambiente e a remoção dos produtos residuais. Uma vez que a transferência de massa só ocorre na superfície extracelular, é relativamente fácil consegui-lo para uma única camada de células. À medida que a massa celular aumenta, a superfície para troca aumenta – tal como a massa das células que requerem esta troca. Assim, no desenvolvimento de formas de andaime, estas considerações devem ser tidas em conta para permitir a aquisição e sobrevivência nutricional adequada (2). Como Joseph Vacanti descreveu tão eloquentemente este problema, “…mais vale tentar cultivar uma planta doméstica dentro de uma bola de basquetebol (3)”. Em busca de uma resposta a esta questão fundamental, Vacanti afirma que a ideia lhe surgiu quando estava a observar algas marinhas na costa do Cabo Cod durante umas férias em família. Sob a pele da alga marinha encontra-se uma rede ramificada de ramos ocos que satisfazem o volume de superfície às necessidades da área e fornecem oxigénio fresco ao organismo ao mesmo tempo que descartam os subprodutos de resíduos. Este desenho de algas marinhas de uma rede ramificada inspirou a utilização de polímeros muito mais arejados, “tipo bola de algodão”, em experiências futuras (2).
br> anos mais tarde, em 1991, outro grande avanço experimental ocorreu sob a liderança do Dr. Charles Vacanti na Faculdade de Medicina da Universidade de Massachusetts (1). O grupo foi capaz de desenvolver com sucesso placas homogéneas de cartilagem cada uma pesando até 100mg, utilizando modelos sintéticos biodegradáveis carregados com condrócitos. Estes andaimes foram depois implantados sob a pele de ratos atípicos e analisados. A cartilagem recém-formada manteve a forma e dimensões relativas dos modelos originais após a reabsorção do polímero. Além disso, foram observadas lacunas nos espécimes colhidos aos 81 dias e não nos colhidos aos 49 dias ou antes. Estas descobertas sugerem que o tecido amadureceu de metal para cartilagem adulta. Em apoio desta conclusão, foi observado colagénio do tipo III, característico da cartilagem hialina imatura de mamíferos nas amostras mais jovens, enquanto que o colagénio do tipo II, característico da cartilagem madura de mamíferos, foi observado em amostras implantadas durante mais de 49 dias (1). Isto foi realizado por Puelacher et al. em 1993, quando desenvolveram modelos de cartilagem nasal humana usando malha de PGA não tecida que foram coladas com uma solução de 5% de ácido poliláctico. Estas formas poliméricas foram semeadas com uma suspensão de crondrócitos obtidos a partir de cartilagem hialina bovina recém-nascida. Estes contrutos foram então implantados em ratos atípicos durante 8 semanas. A análise revelou que o tamanho e a forma dos implantes foi mantida após a reabsorção do polímero deixando um tecido relativamente resistente que era capaz de restaurar a sua confirmação original após a dobra (1).
The Classic Mouse Experiment
The Objective
br>Total ear reconstruction is a very challenging issue for plastic cirurons due to the complex structure of the ear and the tissue has a limited ability to regenerate (2). No entanto, haveria sérios benefícios clínicos em ter um método de regeneração melhorado para lactentes que nascem diariamente com orelhas pouco desenvolvidas e outros perdem estes órgãos em experiências traumáticas (1). Actualmente existem duas grandes alternativas para a reconstrução total do ouvido externo: implantes aloplásticos e enxertos autógenos de cartilagem. Os implantes aloplásticos são tipicamente feitos de silicone ou polipropileno em formas pré-fabricadas. Uma vantagem deste método é que os materiais estão disponíveis num fornecimento relativamente ilimitado e não é necessário trabalho de parto ou tempo adicional para moldar o dispositivo à medida que vêm pré-formados. No entanto, estes materiais são altamente susceptíveis a infecções e não apresentam uma durabilidade a longo prazo. Por outro lado, a utilização de tecidos autógenos tem melhor durabilidade a longo prazo, mas é necessária uma troca por muito tempo para moldar o andaime e há frequentemente um fornecimento insuficiente de cartilagem utilizável (4).
Nos anos 90, Vacanti e Langer fizeram crescer com sucesso uma orelha na parte de trás de um rato atípico que apelidaram de Auriculosaurus (3) (ver Figura_).
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A ciência por detrás dela
Construção do dispositivo
Para construir a forma e dimensões reais do dispositivo de andaime, a orelha de uma criança de 3 anos de idade foi moldada utilizando alginato como material de impressão. Foi então criado um molde de gesso a partir da impressão de alginato e utilizado como molde para a concepção das construções de polímero sintético biodegradável. O polímero utilizado era composto por fibras de ácido poliglicólico numa malha não tecida de aproximadamente 100um de espessura com um diâmetro de aproximadamente 15um. As fibras da malha foram depois coladas após imersão numa solução de ácido poliláctico a 1% durante 2 segundos. Após este processo, o polímero foi moldado na forma da orelha utilizando o molde de gesso e os dispositivos foram colocados em pratos de cultura de tecido de poliestireno de 35 mm (4).
Isolamento de condrócitos
De acordo com Cao et al., os condrócitos foram obtidos a partir de forelimbras de vitelos “recém-abatidos” após recepção no matadouro local. As células foram retiradas das superfícies articulares das articulações e submetidas a digestão da colagenase, centrifugação, filtração, e várias condições tampão em preparação para o processo de sementeira (4).
Carregando o polímero e a implantação em ratos atípicos
Para semear os polímeros com as células bovinas dissociadas, alíquotas de 3mL da suspensão de condrócitos constituída por 1,5×10^8 células colocadas sobre os polímeros e autorizadas a incubar durante 4 horas a 37 graus Celsius para promover a fixação às fibras (ver Figura_). O meio de cultura foi melhorado com 10% de soro fetal, 5 ug/mL de ácido ascórbico, 292 ug/mL de L-glutamina, 100 ug/mL de penicilina, e 100 ug/mL de estreptomicina. As matrizes foram incubadas a 37 graus Celsius em 5% de CO2 durante 1 semana e o meio de cultura foi substituído a cada 48 horas (papel). Imagens de microscópio electrónico de varrimento mostram a fixação dos cronócitos à matriz antes da incubação e também mostram a presença de componentes extracelulares matriculados pelas células, o que confirma a sua respectiva capacidade de desempenhar funções diferenciadas.Após a incubação, os dispositivos foram subcutaneamente implantados nos ratos atípicos masculinos de 4-6 semanas de idade, utilizando procedimentos cirúrgicos estéreis e anestesia geral (4).
>h2>Resultados
P>Embora a montagem experimental deste procedimento tenha sido conceptualmente simplista, os resultados produziram uma visão inestimável da ideia de tecido de engenharia para regeneração por meio de andaimes 3D. Após 6 semanas de incubação in vivo, o grupo de controlo não exibiu vestígios de formação de cartilagem. Após a remoção do stent, a pele dos ratos manteve a sua aparência original e o polímero foi reabsorvido como esperado. No entanto, os resultados mais significativos foram em relação às diferenças observadas nos grupos experimentais I e II. Após 3-4 semanas de incubação in vivo, as diferenças na forma da orelha tornaram-se aparentes. Os espécimes do grupo experimental I têm uma morfologia quase idêntica à do implante que foi bem estabelecido após 4 semanas e foi mantido durante as 8 semanas adicionais após a remoção do stent (ver Figura _). Em contraste, os ratos do grupo experimental II desenvolveram uma orelha que só se assemelhava aproximadamente à do andaime de polímero, uma vez que foi reduzida em tamanho e distendida em forma como é aparente na Figura _ (4).
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A Resposta Social
P>Embora para a comunidade científica e para os pioneiros da engenharia de tecidos, esta descoberta foi monumental e de saída abrindo inúmeras vias de investigação e levantando questões científicas valiosas, teve uma resposta igualmente forte sobre a comunidade científica. Na sequência da publicação do artigo de Vacanti em Agosto de 1997, o grupo anti-genetics e os activistas dos direitos dos animais expressaram uma forte oposição. Esta resposta social desfavorável foi facilitada por um filme realizado pela BBC’s Tomorrow’s World, bem como por um anúncio que foi retratado no New York Times pelo grupo chamado The Turning Point Project (ver Figura 6).
O anúncio mostrava a imagem do rato Vacanti com um capitão enganador que dizia, “Esta é uma fotografia real de um rato geneticamente modificado com uma orelha humana nas costas”. Esta afirmação implicava que os cientistas tinham alterado o genoma do rato através da inserção de segmentos de ADN humano. A forte resposta que foi suscitada pelos grupos sociais persiste ainda hoje e algumas das legendas clássicas do artigo são listadas abaixo para ajudar a fomentar uma melhor compreensão de como a comunidade social estava a perceber estes avanços científicos (5):
“Alguém pensa que é chocante, portanto, que esta indústria de biotecnologia infantil sinta que não há problema em captar o processo evolutivo e remodelar a vida na terra para se adequar aos seus balanços?”
Até agora, não existem “quimeras” meio-humanas, meio-animalesas (como sereias ou centauros), mas podemos tê-las em breve”
“As empresas biotecnológicas estão a remover alegremente componentes de seres humanos (e outras criaturas) e a tratar-nos a todos como autopeças numa reunião de troca.”
“Um dia, quando uma destas empresas finalmente decidir que o humor público está receptivo, será que vão fazer uma combinação homem-gorila para cuidar de trabalho pesado?”
“Será que perdemos a nossa sanidade”? (5)
>br>>>>p>>>br>>>/p>p>(1) Atala, Anthony, e David J. Mooney. Andaimes de Polímeros Biodegradáveis Sintéticos. Boston: Birkhäuser, 1997. Print.
(2) Vacanti, Joseph. “Tissue Engineering and Regenerative Medicine”. Palestra. A palestra “Jayne Lecture”. Amphilsoc. Web.
(3)D’Agnese, Joseph. “Irmãos de Coração”. Descobrir Julho de 2001. Revista Discover. 1 de Julho de 2001. Web.
(4)Cao, Yilin, Joseph P. Vacanti, Keith T. Paige, Joseph Upton, e Charles A. Vacanti. “Transplante de Condrócitos Utilizando uma Construção de Células Poliméricas para Produzir Cartilagem Tecido-Engenharia em Forma de Ouvido Humano”. Cirurgia Plástica e Reconstrutiva 100.2 (1997): 297-302. Print.
(5)Rato, Roger. “Quem Joga Deus no Século XXI”? New York Times 25 de Maio de 2001, 9ª ed., seg., New York Times 25 de Maio de 2001, 9ª ed., seg. 62. Print.