High-Hroughput Advances for Chronological Life Span and New Attention for Quiescent Cells
CLS em S. cerevisiae e S. pombe usa ensaios semelhantes para determinar quanto tempo as células podem sobreviver em cultura líquida após a glicose e vários outros nutrientes terem sido esgotados (Longo et al.., 2012; Chen e Runge, 2009, 2012; Fabrizio e Longo, 2003; Zuin et al., 2008, 2010). Porque as células paradas por fome, a detecção de nutrientes e a degradação dos componentes proteicos internos por autofagia desempenham papéis importantes no CLS (Sideri et al., 2014; Yamaguchi e Otsu, 2012; Alvers et al., 2009a,b; Aris et al., 2012, 2013). A concepção dos ensaios do CLS exige que se tenham em mente alguns pontos-chave. Primeiro, se o ensaio CLS for para ser modelo para outros organismos, então o ensaio deve ter os mesmos efeitos sobre a levedura que o ensaio análogo tem sobre outros modelos. Para a maioria dos organismos, estas características incluem a extensão da vida útil por restrição calórica, e estas células de vida longa são frequentemente resistentes ao stress (por exemplo, Fabrizio et al., 2001). Embora as condições tenham sido estabelecidas para S. cerevisiae há muito tempo, o meio sintético primário utilizado no campo de S. pombe, chamado Edinburgh Minimal Medium (EMM ou EMM2), não recapitula estas características conservadas de duração de vida e restrição calórica (Chen e Runge, 2009). Em vez disso, S. pombe requer um meio SIM rico (extracto de levedura (YE) e suplementos (S) e fonte de carbono) ou um meio chamado SD (um meio sintético derivado quimicamente (S) mais dextrose (D)) com diferentes níveis de componentes que o EMM (Chen e Runge, 2009; Zuin et al., 2010). Em segundo lugar, o ensaio deve incorporar informação sobre o organismo modelo. S. cerevisiae e S. pombe podem crescer rapidamente populações inteiras a partir de uma única célula, algo que não pode ser feito com humanos ou ratos. As leveduras, portanto, podem regular as suas maquinarias centrais de forma diferente, uma vez que a maioria das células da cultura morre (por exemplo, passando de ∼108 para 10 células/mL) em comparação com quando o número de células cai para 1% do nível original (de ∼108 para 106 células/mL). De facto, S. cerevisiae comportam-se de forma complexa num ensaio CLS, pois quando as células caem para ∼0.1% da densidade original de células vivas por ml num ensaio CLS, uma fracção de células começará a regredir (Fabrizio et al., 2004) (Fig. 30.2B). As células também se envenenam ao segregar pequenos ácidos orgânicos (por exemplo, ácido acético) para o meio (Burtner et al., 2009). Este comportamento complexo exige que a maioria dos ensaios de S. cerevisiae CLS não ultrapasse muito uma perda de viabilidade inferior a 1%. Em contraste, o ensaio de S. pombe CLS pode mostrar uma queda na viabilidade por 5-6 ordens de magnitude sem recrescimento, o que permite isolar mais facilmente as células de vida longa (Chen e Runge, 2009; Chen et al., 2013).
p>Both S. cerevisiae e S. pombe têm sido usados para rastrear os seus respectivos conjuntos de estirpes de eliminação de todo o genoma para mutantes com CLS estendido. Cada eliminação de genes é marcada por uma sequência única de ADN ou código de barras. Estes ensaios CLS incluíram a sobrevivência em placas de microtitulação (Powers et al., 2006) ou o ensaio padrão utilizando os códigos de barras associados às eliminações para identificar os mutantes associados a diferentes períodos de vida. As frequências dos códigos de barras foram determinadas utilizando a hibridação de microarranjos (Wei et al., 2008) ou abordagens de sequenciação de códigos de barras (Chen et al., 2013; Sideri et al., 2014). Foram também identificados genes adicionais que estendem o CLS em sobreexpressão (Ohtsuka et al., 2009; Miwa et al., 2011). Embora a lista de genes que regulamentaram o tempo de vida não seja revista aqui, é importante notar que os TOR surgiram como um importante regulador do tempo de vida em ambas as leveduras (Powers et al., 2006; Wei et al., 2008; Sideri et al., 2014). Em geral, os ensaios padrão CLS produziram uma grande quantidade de informação que realça a importância de um conjunto de vias evolutivamente conservadas que controlam o envelhecimento (Longo et al., 2012).
Os resultados dos ensaios CLS apresentam alguns puzzles. Porque é que S. cerevisiae é tão variável no final do CLS? Porque é que S. pombe tem um CLS tão curto (14 dias)? Embora as respostas a estas perguntas não sejam conhecidas, uma possibilidade é que os ensaios faltam características evolutivas não apreciadas em ambas as espécies. Uma dessas características que normalmente não é considerada é outro estado diferenciado de levedura que ocorre nos ensaios CLS, a célula G0 quiescente ou célula Q.
Quando S. cerevisiae cresce até à saturação e permanece em cultura, uma fracção de células diferencia-se em pequenas células densas que podem ser isoladas do resto da população (Allen et al., 2006) (Fig. 30.2D). Estudos mais recentes mostraram que as células Q podem ser separadas das outras células através da separação de células activadas por fluorescência para análise (Miles and Breeden, 2017). Estas células têm propriedades notáveis em termos de CLS. Podem sobreviver durante quase 1 ano em água, são altamente resistentes ao stress, e reentram sincronicamente no ciclo celular quando lhes são adicionados nutrientes (Allen et al., 2006; Miles and Breeden, 2017). O facto de formarem alguns dias após o início de um CLS indica que provavelmente estão a desempenhar um papel na análise das células CLS. Se a presença agora apreciada de células Q nos ensaios de S. cerevisiae CLS faz alguma diferença em relação às conclusões anteriores extraídas das mesmas não é actualmente clara. O laboratório Breeden analisou intensamente as células S. cerevisiae Q nos últimos anos, tendo-se demonstrado que os repressores transcripcionais e os remodeladores de cromatina (por exemplo, Xbp1 e Rpd3) desempenham papéis-chave neste processo (Miles and Breeden, 2017; Miles et al., 2013; McKnight et al., 2015). As proteínas conhecidas por desempenharem papéis na transição G1/S do ciclo celular também têm papéis na transição para a quiescência (por exemplo, o complexo de transcrição SBF), e estes complexos centrais são adaptados à indução da quiescência pela aquisição de outros factores (por exemplo, Msa1 e Msa2) (Miles et al., 2016). Assim, ao aproveitar a informação das células ciclistas, a maquinaria celular central que rege a entrada no G0 está a ser elucidada. Como a identificação de tais máquinas nucleares é um objectivo importante da investigação sobre o envelhecimento, este trabalho representa um importante passo em frente. Um importante esforço futuro exigirá determinar que outros processos celulares estes caminhos conservados controlam.
Quiescência em S. pombe é algo diferente. Quando S. pombe é acasalado em laboratório, duas células de tipos opostos de acasalamento são colocadas juntas num meio que carece de azoto reduzido (-N médio). A falta de nitrogénio induz um sinal que inicia o programa de acasalamento e leva à esporulação para produzir esporos haplóides. No entanto, se um parceiro de acasalamento não estiver presente, as células entram lentamente num estado G0 caracterizado pela pomba S. em forma de vara, tornando-se pequenas células redondas. Estas células podem sobreviver durante meses e reentrar no ciclo celular quando o azoto é adicionado de volta ao meio e são assim células Q para esta espécie (Su et al., 1996; Yanagida, 2009). É importante notar que estas células Q não são observadas em culturas que deixam de crescer para não esgotarem os seus abastecimentos de glucose (revisto em Yanagida, 2009). Como a exaustão da glicose é o que causa a paragem durante a S. pombe CLS (Fig. 30.2E); as pequenas células Q redondas parecem improváveis de desempenhar um papel importante nestes ensaios.
Foi feita uma quantidade substancial de análise e caracterização do transcriptoma para determinar que genes são necessários para fazer células Q de S. pombe. O resultado tem sido a identificação de genes para proteínas que actuam em quase todos os compartimentos celulares (Yanagida, 2009; Shimanuki et al., 2007). Um grande desafio é determinar como estes muitos actores são coordenados para governar o estabelecimento, manutenção, e desmontagem do estado das células Q, de facto o oposto da situação em S. cerevisiae, onde partes do núcleo da maquinaria são conhecidas. O trabalho futuro determinará como a informação proveniente destas duas leveduras pode ajudar a preencher as nossas lacunas na compreensão do estado de Q-células e se existem diferenças fundamentais, como se vê na replicação do envelhecimento.