Estudos epidemiológicos subsequentes sugeriram que o SME estava ligado a lotes específicos de L-triptofano fornecidos por um único grande fabricante japonês, Showa Denko. Acabou por se tornar claro que lotes recentes de L-triptofano da Showa Denko foram contaminados por impurezas vestigiais, que posteriormente se pensou serem responsáveis pelo surto de EMS de 1989. O L-triptofano foi produzido por uma bactéria cultivada em cubas abertas numa fábrica de fertilizantes da Showa Denko. Enquanto um total de 63 contaminantes vestigiais foram eventualmente identificados, apenas seis deles puderam ser associados ao EMS. O composto EBT (1,1′-etilideno-bis-L-triptofano, também conhecido como “pico E”) foi o único contaminante identificável pela análise inicial, mas análises posteriores revelaram PAA (3-(fenilamino)-L-alanina, também conhecido como “UV-5″), e pico 200 (2-L-triptofano). Dois dos restantes picos não caracterizados associados à EMS foram posteriormente determinados como sendo 3a-hidroxi-1,2,3,3,3a,8a-hexahidropyrrolo–indole-2 ácido carboxílico (pico C) e 2-(2-hidroxi indolina)-triptofano (pico FF). Estes foram caracterizados usando massa precisa LC-MS, LC-MS/MS e espectrometria de massa em várias fases (MSn). O último dos seis contaminantes (pico AAA/”UV-28”, sendo “o contaminante mais significativamente associado ao EMS” foi caracterizado como dois isómeros em cadeia relacionados; pico AAA1 ((S)-2-amino-3-(2-((S,E)-7-methylnon-1-en-1-yl)-1H-indol-3-yl)ácido propanóico, um produto de condensação entre o ácido L-triptofanoico e o ácido 7-metilnonanóico) e o pico AAA2 ((S)-2-amino-3-(2-((E)-dec-1-en-1-yl)-1H-indol-3-yl)propanóico, um condensado entre o L-triptofano e o ácido decanóico). Nenhuma relação consistente foi alguma vez firmemente estabelecida entre qualquer impureza ou impurezas vestigiais específicas identificadas nestes lotes e os efeitos da EMS. Embora o EBT em particular tenha sido frequentemente implicado como o culpado, não há associação estatisticamente significativa entre os níveis de EBT e EMS. Dos 63 contaminantes vestigiais, apenas os dois compostos de AAA apresentaram uma associação estatisticamente significativa com casos de SME (com um valor p de 0,0014).
Como a maioria da investigação se concentrou em tentativas de associar contaminantes individuais ao SME, há uma falta comparativa de investigação detalhada sobre outros possíveis factores causais ou contribuintes. O próprio triptofano tem sido implicado como um factor potencialmente contribuinte importante no SME. Embora os críticos desta teoria tenham argumentado que esta hipótese não explica os relatórios quase inexistentes do SME antes e depois do surto de EMS, isto não tem em conta o aumento súbito e rápido da utilização do triptofano imediatamente antes do surto de 1989, e ignora a forte influência do legado do surto de EMS e a proibição alargada da FDA sobre a utilização posterior do triptofano. Crucialmente, isto também ignora a existência de vários casos de EMS que se desenvolveram tanto antes como depois da epidemia primária, incluindo pelo menos um caso em que o triptofano foi testado e se constatou a falta dos contaminantes encontrados nos lotes contaminados de triptofano de Showa Denko, bem como casos com outros suplementos indutores de EMS, e mesmo um caso de EMS induzido por ingestão excessiva de L-triptofano através do consumo excessivo de castanhas de caju. Uma importante análise canadiana localizou uma série de doentes que cumpriam os critérios do CDC para o SEM mas nunca tinham sido expostos ao triptofano, o que “põe em causa as interpretações causais de estudos anteriores”. Outros estudos evidenciaram numerosas falhas importantes em muitos dos estudos epidemiológicos sobre a associação do triptofano ao SEM, o que lança sérias dúvidas sobre a validade dos seus resultados. Como concluiu a FDA, “outras marcas de L-triptofano, ou o próprio L-triptofano, independentemente dos níveis ou da presença de impurezas, não puderam ser eliminadas como causal ou contribuindo para o desenvolvimento do SME”. Mesmo estudos com animais sugeriram que o próprio triptofano “quando ingerido por indivíduos susceptíveis, isoladamente ou em combinação com algum outro componente do produto, resulta nas características patológicas do SME”.
Na altura do surto, Showa Denko tinha recentemente feito alterações aos seus procedimentos de fabrico que se pensava estarem ligadas à possível origem dos contaminantes detectados nos lotes de triptofano afectados. Uma alteração fundamental foi a redução da quantidade de carvão activado utilizado para purificar cada lote de >20 kg para 10 kg. Uma porção dos lotes contaminados tinha também contornado outra etapa de filtração que utilizava a osmose inversa para remover certas impurezas. Além disso, a cultura bacteriana utilizada para sintetizar triptofano era uma estirpe de Bacillus amyloliquefaciens que tinha sido geneticamente modificada para aumentar a produção de triptofano. Embora as quatro gerações anteriores da estirpe geneticamente modificada tivessem sido utilizadas sem incidentes, pensava-se que a quinta geração utilizada para os lotes contaminados era uma possível fonte das impurezas que foram detectadas. Isto foi mal utilizado para argumentar que a própria engenharia genética era a causa primária da contaminação, uma posição que foi fortemente criticada por ignorar as outras causas conhecidas de contaminação não GMO, bem como pela sua utilização por activistas anti-GMO como forma de ameaçar o desenvolvimento da biotecnologia com informações falsas. A redução da quantidade de carbono activado utilizada e a introdução da estirpe de Bacillus amyloliquefaciens de quinta geração foram ambas associadas ao desenvolvimento do SME, mas devido à elevada sobreposição destas alterações, a contribuição independente precisa de cada alteração não pôde ser determinada (embora se tenha determinado que o desvio da filtragem de osmose inversa para certos lotes não estava significativamente associado aos lotes contaminados de triptofano). Enquanto que a Showa Denko alegou uma pureza de 99,6%, notou-se que “as quantidades dos contaminantes conhecidos associados ao SME, EBT e PAA, eram notavelmente pequenas, da ordem de 0,01%, e podiam facilmente escapar à detecção”.
Resposta regulamentarEditar
A FDA afrouxou as suas restrições de vendas e comercialização de triptofano em Fevereiro de 2001, mas continuou a limitar a importação de triptofano não destinado a uma utilização isenta até 2005.