O isolamento comportamental é um mecanismo comum e potente de isolamento reprodutivo. Determinar até que ponto o isolamento comportamental varia com as condições ambientais é fundamental para compreender a especiação e a manutenção dos limites das espécies. Aqui, testamos o efeito da salinidade no isolamento comportamental (reconhecimento de espécies femininas, competição macho-macho, e reconhecimento de espécies masculinas) entre dois killifish estreitamente relacionados (Lucania goodei e L. parva) que diferem na tolerância à salinidade. Realizámos ensaios sem escolha e ensaios comportamentais em que os machos podiam competir e cortejar as fêmeas em água doce (0 ppt) e água salobra (15 ppt). Encontrámos níveis elevados de isolamento comportamental que não variavam em função da salinidade. Nos ensaios comportamentais, o reconhecimento das espécies masculinas das fêmeas era forte e assimétrico entre as duas espécies. Os machos de Lucania goodei preferiam os conspecíficos e raramente cortejavam ou acasalavam com as fêmeas de L. parva. Os machos de Lucania parva preferiam os conspecíficos mas rapidamente cortejados e acasalados com as fêmeas de L. goodei. Esta assimetria corresponde a assimetrias previamente documentadas na aptidão dos descendentes híbridos. Os cruzamentos entre machos de L. parva e fêmeas de L. goodei produzem híbridos totalmente viáveis/ferteis, mas os cruzamentos entre machos de L. goodei e fêmeas de L. parva produzem machos com fertilidade reduzida. Assim, o isolamento comportamental pode ter evoluído em parte devido ao reforço.