9.5 Rolle von Nanobiosensoren in der TB-Diagnostik
Das Tuberkel-Bakterium ist wachstumsschwach und benötigt 1-2 Monate für das in vitro Wachstum (Tortoli et al., 1997; Davies et al., 1999). Daher ist es schwierig, das Vorhandensein einer Infektion im Frühstadium zu erkennen. Die Ziehl-Neelsen-Färbung ist die konventionelle Methode zu seiner Identifizierung. Diese Färbung wird für die vorläufige Identifizierung des verursachenden Organismus benötigt, aber es mangelt ihr an Sensitivität (Moore und Curry, 1998; Mahaisavariya et al., 2005). Die konventionellen Methoden zur Kultivierung von Mykobakterien sind zeitaufwändig und benötigen mehrere Wochen. Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist eine empfindliche Methode zur Früherkennung von Mykobakterien, aber der Amplifikationsprozess erfordert viel Zeit, Chemikalien und Reagenzien, die zu den hohen Kosten des Tests beitragen. Außerdem ist er arbeitsintensiv und teuer (Tombelli et al., 2000; Minnuni et al., 2005). Daher besteht ein dringender Bedarf an der Entwicklung einer schnellen, kostengünstigen und bequemen Diagnosemethode zum Nachweis von TB. In dieser Hinsicht scheinen Biosensoren eine gute Option zu sein. Es besteht ein zunehmender Bedarf an Biosensortechnologie zum schnellen und präzisen Nachweis von TB mit hoher Affinität und Spezifität. Die Biosensortechnologie hat das Potenzial, eine qualitative und quantitative Analyse zu liefern und ist frei von radioaktiven oder fluoreszierenden Markierungen (Tombelli et al., 2000, Zhou et al., 2001; Yao et al., 2008).
In den letzten Jahren wurden angesichts der Vorteile verschiedener bemerkenswerter Studien, die in der Nanotechnologie durchgeführt wurden, wichtige Anstrengungen unternommen, diese mit der hochempfindlichen und genauen Biosensortechnologie zu kombinieren, um Nanobiosensoren zu entwickeln. Nanobiosensorsysteme werden effizient in der Diagnose von Krankheiten, der Umweltüberwachung, der Kontrolle der Lebensmittelqualität und der Verteidigung als intelligenter Ansatz eingesetzt (Zhou et al., 2011; Rai et al., 2012; Singh et al., 2014). Durch die Verwendung von goldbeschichteten Nanobiosensoren demonstrierten Duman et al. (2009) beispielsweise die Detektion von Zielmolekülen (synthetische und PCR-Produkte) sehr effektiv auf nanomolarem Niveau. Ein einzelsträngiges Oligodeoxynukleotid, das am Ende eine Thiolgruppe trägt und komplementär zur charakteristischen Zielsequenz des MTB-Komplexes ist, wurde als Sonde verwendet, die auf der goldbeschichteten Oberfläche der Oberflächenplasmonenresonanz-Schieber immobilisiert wurde. Interessant ist, dass die Sensorplattform wiederverwendbar ist und eine lange Haltbarkeit aufweist. Ein Quarzkristall-Mikrowaage (QCM) Biosensor in Kombination mit AuNPs wurde für den Nachweis von MTB entwickelt (Kaewphinit et al., 2012). Laut der Studie verbesserten die AuNPs die Empfindlichkeit der immobilisierten Goldelektrode des Quarzkristalls unter Verwendung der spezifischen Thiol-modifizierten Oligonukleotid-Sonde. Es wurde gezeigt, dass die QCM bis zu 5 pg genomischer MTB-DNA nachweisen kann, ohne eine Kreuzhybridisierung mit anderen Mykobakterien zu zeigen.
In den letzten Jahren haben viele Techniken die Materialien auf der Nanoskala-Ebene für die Entwicklung von Biosensoren mit hoher Spezifität und Wirksamkeit genutzt. Unter allen Nanomaterialien sind Metalloxide aufgrund ihrer einzigartigen physikalischen, chemischen und katalytischen Eigenschaften von besonderem Interesse (Shi et al., 2014). Das et al. (2010) haben einen wichtigen Versuch unternommen, die Anwendung solcher Metalloxide bei der Erzeugung von Nanobiosensoren zum Nachweis von Mykobakterien zu diversifizieren. Sie haben nanoskaliges Zinkoxid auf die Indium-Zinn-Oxid (ITO)-beschichtete Glasplatte abgeschieden. Das Vorhandensein von nanostrukturierten ZnO-Filmen ermöglichte eine Vergrößerung der elektroaktiven Oberfläche für die Beladung mit DNA-Molekülen und für den Nachweis genomischer Ziel-DNA bis zu 100 pM, was den direkten Nachweis von Krankheitserregern in klinischen Proben am Point of Care ermöglicht. Die Hauptmerkmale der Technik sind: (i) die kovalente Immobilisierung des Sensors ohne Verwendung eines Vernetzers, der die Sensitivität einschränken könnte; (ii) die Nachweisgrenze von 0,065 ng/µL; (iii) der Nachweisprozess benötigt nur 60 s; (iv) kann bis zu 10 Mal wiederverwendet werden; und (v) ist bis zu 4 Monate bei 4°C stabil. Daher ist er ein effizienter Nanobiosensor für die schnelle und genaue Diagnose von Mykobakterien (Das et al., 2010). Zirkoniumoxid (ZrO2) ist ein wichtiges Metalloxid mit größerer Stabilität und Inertheit. Außerdem hat es eine Affinität zu sauerstoffhaltigen Gruppen. Das et al. (2011) entwickelten Nanokomposit-basierte Nukleinsäure-Nanobiosensoren aus Zirkoniumoxid und Kohlenstoff-Nanoröhrchen (NanoZrO2-CNT), die auf ITO abgeschieden wurden. Die Gruppe nutzte diese Elektrode (NanoZrO2-CNT/ITO) für die Immobilisierung von einzelsträngiger Sonden-DNA (ssDNA), die spezifisch für MTB ist, um ihre Anwendung als Biosensor für den Nukleinsäurenachweis aufzuzeigen.
Thiruppathiraja et al. (2011) stellten den elektrochemischen DNA-Biosensor für genomische DNA von Mycobacterium sp. her und evaluierten ihn unter Verwendung eines Signalverstärkers in Form von zweifach markierten Gold-Nanopartikeln (AuNPs). Die Methode beinhaltet die Sandwich-Detektionsstrategie mit zwei Arten von DNA-Sonden: die Sonden des Enzyms ALP und die Detektorsonde, die an AuNPs konjugiert ist. Diese beiden Sonden waren spezifisch für genomische DNA von Mycobacterium sp. Die Studie behauptete, dass unter optimierten Bedingungen die Nachweisgrenze der Methode bei 1,25 ng/mL genomischer DNA lag. Die besagten Nanobiosensoren waren ebenfalls vielversprechend und die Auswertung der klinischen Sputumproben zeigte die höhere Sensitivität und Spezifität. Eine andere Studie (Torres-Chavolla und Alocilja, 2011) stellte mit unterschiedlichen Ansätzen ebenfalls den DNA-basierten Biosensor her, der AuNPs und Amin-terminierte magnetische Partikel (MPs) zum Nachweis der Mykobakterien umfasste. Die Studie nutzte die thermophile Helikase-abhängige isotherme Amplifikation (tHDA) und Dextrin-beschichtete AuNPs als elektrochemische Reporter. Die AuNPs und MPs wurden unabhängig voneinander mit verschiedenen DNA-Sonden funktionalisiert, die spezifisch mit einem Fragment innerhalb eines Gens der Mykobakterien hybridisieren. Später trennte diese Gruppe den MP-Target-AuNPs-Komplex magnetisch aus der Lösung und wies die AuNPs elektrochemisch nach. Torres-Chavolla und Alocilja (2011) gaben an, dass die Empfindlichkeit dieser Methode bei 0,01 ng/μL eines isothermisch amplifizierten Targets von 105 bp liegt. Ein solcher Sensor kann somit zur regelmäßigen Analyse von klinischen Proben mit Verdacht auf Mykobakterien eingesetzt werden.
Neben Metalloxid-Nanopartikeln erhält auch poröses Silizium mehr Aufmerksamkeit in Bezug auf Biosensoranwendungen, vor allem in markierungsfreien Anwendungen. Wu et al. (2012) nutzten einen nanoskaligen porösen Silizium-Mikrokavitäten-Biosensor für die schnelle Serodiagnose von MTB. Durch eine Reihe von Experimenten belegte die Studie die Machbarkeit dieses Biosensors für den Nachweis der Interaktion zwischen 16 kDa Antigen und 16 kDa Antikörper. Der Nachweis von MDR-TB ist von größter Bedeutung. In einer aktuellen Studie berichteten Li et al. (2014) über die Entwicklung eines DNA-Sensors für den spezifischen Nachweis des rpoB-Gens von MDR-TB unter Verwendung von Ruthenium(II)-Komplex-funktionalisiertem Graphemoxid (Ru-GO) als Suspensions-Sensor-Interface und Ferrocen-markierter einzelsträngiger DNA (FC-ssDNA) als Elektrochemilumineszenz (ECL)-Intensitätsregler. Der Assay basiert auf dem Prinzip, dass das mutierte ssDNA-Target bei Hybridisierung mit FC-ssDNA von der Ru-Go-Oberfläche freigesetzt wird, was zu einer Wiederherstellung der ECL führt. Der Assay soll einen Detektionsbereich von 0,1 bis 100 nM und eine Sensitivität von 0,04 nM haben.
Weitere Studien sind notwendig, die sich hauptsächlich auf die Herstellung verschiedener Nanobiosensoren für die Diagnose einer solch schrecklichen Krankheit konzentrieren. Da diese Technik hochempfindlich ist, wenig Probenvorbereitung erfordert und schnell, spezifisch, billig und einfach zu verwenden ist, hat sie großes Potenzial für die klinische Diagnose von TB.