Charles Mayo nació en Rochester, Minnesota, el 19 de julio de 1865, hijo de William Worrall Mayo, nativo de Inglaterra y médico generalista que se había establecido en el territorio de Minnesota en 1855.
El joven acompañó a su padre y a su hermano mayor, William J. Mayo, en innumerables viajes tanto en el pueblo como en el campo cuando el padre viajaba a sus pacientes. En varias ocasiones administró éter a los pacientes antes de que obtuviera el título de médico.
Charles Mayo estudió en las escuelas públicas de Rochester, y obtuvo el título de Doctor en Medicina por la Universidad de Northwestern en 1888. Cuando Mayo llevaba alrededor de un año en casa, ayudando a su padre y a su hermano mayor en la práctica de la medicina general, las hermanas de San Francisco fundaron el Hospital St. Charles era uno de los tres miembros del personal del nuevo hospital, los otros dos eran su padre y su hermano mayor. En años posteriores, el hermano mayor recordaba: «Charlie pronto me impulsó a cubrirme siendo un mejor cirujano, y comencé a especializarme en el trabajo abdominal y en las operaciones de los uréteres y los riñones». Podía dominar una situación difícil con una rapidez excepcional, y tenía facilidad para una variedad de problemas quirúrgicos desafiantes que pronto lo encontraron realizando procedimientos tan disímiles como la escisión de una articulación de la rodilla, la sección del ganglio gasseriano y la histerectomía. También adquirió un alto grado de destreza en las operaciones de los ojos, la cabeza y el cuello, mientras que su hermano se concentró en las operaciones abdominales.
Se dedicó a la extensa práctica que él y su hermano llevaron a cabo juntos, después de que su padre se retirara de la práctica activa alrededor de 1890. Los dos hermanos consiguieron la ayuda de un tercer médico en 1892, de otro en 1901 y de muchos más, ya que la consulta fundada por su padre en 1863 se hizo muy conocida en el sur de Minnesota y, posteriormente, en todo el estado.
En 1903 el nombre de Clínica Mayo era conocido no sólo por las personas que solicitaban los servicios de los hermanos y sus asociados, sino por otros médicos ajenos al pequeño grupo de profesionales de Rochester. En 1915, Charles y su hermano crearon la Fundación Mayo para la Educación e Investigación Médica como parte de la Escuela de Postgrado de la Universidad de Minnesota, con becas en varias especialidades. Los Mayo se convirtieron en célebres profesores y fueron considerados con profundo afecto y respeto por los cientos de jóvenes cirujanos que trabajaron con ellos.
Este clásico artículo ofrece una fascinante perspectiva del estado de la cirugía de colon y recto a principios de siglo. En él Mayo sugiere la conveniencia del abordaje combinado sincrónico «si el cirujano tiene un buen asistente». Se cree que fue el primero en recomendar esta maniobra.
A Charles Mayo se le confirieron honores de todo tipo, al igual que a su hermano mayor. Fue elegido presidente de la Western Surgical Association, de la Society of Clinical Surgery, del Clinical Congress of Surgeons of North America, de la American Medical Association, del American College of Surgeons y de la American Surgical Association.
Murió en Chicago, donde había contraído una penumonía durante una visita, el 26 de mayo de 1939, a la edad de 73 años. La muerte de su hermano se produjo dos meses después.