La importancia de los animales de experimentación en la enseñanza y la investigación no puede dejar de enfatizarse. Los estudios que utilizan modelos animales tienen ventajas como la disponibilidad de sujetos experimentales, la posibilidad de realizar pruebas invasivas, la toma de muestras de tejido extensas y la estandarización de la gravedad de la enfermedad y la posibilidad de profilaxis . Otras ventajas son el manejo seguro de los sujetos, la eliminación de la deserción del estudio (excepto en casos de mortalidad) y las condiciones experimentales controladas. Aunque la elección del animal en la investigación biomédica para una determinada investigación puede ser controvertida y muy discutida, los animales de experimentación utilizados habitualmente son los ratones, las ratas y los conejos. Los roedores pequeños, como los ratones y las ratas, son más preferidos que los animales más grandes, como los conejos, los perros, los gatos, los cerdos y los monos.
En la investigación de la función reproductiva, en particular las que implican el uso de animales hembra, se utilizan comúnmente los ratones y las ratas, posiblemente debido a su ciclo estral bien caracterizado y a su manejo seguro. La corta y precisa duración del estro en estos roedores también los hace muy adecuados. La determinación de la fase del estro es esencial para seleccionar un animal hembra que se emparejará con un macho para conseguir un embarazo programado o para seguir el estro como una variable que puede afectar a la investigación. La evaluación del ciclo estral en los animales de experimentación es una medida útil de la integridad del eje hipotálamo-hipófisis-ovario y del funcionamiento del sistema reproductor femenino. También puede utilizarse para investigar los efectos de los fármacos y las sustancias químicas sobre la función reproductiva, expresados con frecuencia como una alteración de la morfología, la citología y la histología típicas de los órganos reproductivos y una alteración de la duración de determinadas fases del ciclo estral.
El ciclo estral
El ciclo estral se refiere al ciclo reproductivo de los roedores. Es similar al ciclo reproductivo humano, comúnmente llamado ciclo menstrual (ciclos ováricos y uterinos). El ciclo estral tiene cuatro fases, a saber, proestro, estro, metaestro y diestro, y dura de 4 a 5 días (Tabla 1). El período reproductivo y el ciclo estral de los ratones comienza alrededor del 26º día después del nacimiento con la apertura de la vagina, que es aproximadamente 10 días antes de la cornificación vaginal. La apertura vaginal mediada por la apoptosis es un carácter secundario esencial en los ratones, que se utiliza como predictor de la pubertad . El desdoblamiento vaginal está asociado a un aumento de la concentración de estradiol. En las ratas, se produce una apertura vaginal durante la primera ovulación .
En las ratas hembras, la pubertad está precedida por la liberación pulsátil de la hormona luteinizante (LH) después de la 4ª semana postnatal, aproximadamente a los 30 días . Este periodo es el anestro y se produce entre 8 y 9 días antes del primer proestro. A continuación se produce el primer proestro, el estro, el metro y el diestro. El metestro sólo se produce en ausencia de concepción.
Por otra parte, en los seres humanos, hay tres fases del ciclo menstrual; la fase menstrual, la proliferativa (folicular) y la secretora (lútea). Este ciclo comienza en la pubertad. Por término medio, dura unos 28 días desde el inicio de una menstruación hasta el comienzo de la siguiente. En la mitad del ciclo, entre las fases proliferativa y secretora, se encuentra la fase ovulatoria durante la cual se produce la ovulación tras el aumento de LH. La fase proliferativa se asocia principalmente con niveles elevados de estrógeno, mientras que la fase secretora se asocia con niveles elevados de progesterona.
La fase de proestro corresponde a la etapa folicular humana, que se asocia con un aumento de las concentraciones de estradiol circulante y un pequeño aumento de la prolactina, lo que conduce a un aumento de la liberación de LH y de la hormona estimulante del folículo (FSH). El pico de concentración de FSH con un rápido descenso asociado de los niveles de estradiol se correlaciona con la ovulación y la fase de celo. El metestro y el diestro son homólogos a las etapas secretoras tempranas y tardías del ciclo reproductivo humano, respectivamente, con altos niveles de progesterona.
Perspectiva histórica
La palabra «estro» fue utilizada por primera vez por Heape . Se trata de una adaptación latina de la palabra griega «oistros» que significa «estación sexual», «tábano», «frenesí», «aguijón» o «locura» . Heape también nombró y definió las fases del ciclo estral de los mamíferos en proestro, metestro, diestro y anestro. El proestro es la fase preparatoria para la entrada en celo de un animal, el metestro es un breve periodo caracterizado por la disminución de las funciones del cuerpo lúteo en ausencia de concepción, cuando las actividades de los órganos reproductores disminuyen gradualmente, el diestrus es un periodo de breve descanso durante la temporada de cría, y el anestro es un periodo sin cría en el que los órganos reproductores están inactivos. Los cambios de comportamiento, así como los cambios morfológicos, citológicos e histológicos en el tracto reproductivo, describen estas fases.
En los primeros días, los cambios macroscópicos en la vulva (como la hinchazón de la vulva), las secreciones vaginales (como el sangrado, y la mucosa), y el útero (como la congestión), así como los cambios microscópicos en el tracto reproductivo se utilizaron para definir las fases del ciclo estral. Sin embargo, los hallazgos macroscópicos no eran fiables en roedores pequeños, y el análisis histológico era y sigue siendo un procedimiento invasivo que no es adecuado para la determinación del ciclo estral en animales vivos. Más tarde, Stockard y Papanicolaou caracterizaron los cambios de la vagina durante el ciclo estral mediante la histología y la citología, lo que evitó los problemas anteriores de falta de fiabilidad e invasividad. Con el tiempo, varios estudios han aprobado la evaluación de Stockard y Papanicolaou; esto llevó a las definiciones existentes de las fases del ciclo estral. La prueba de Papanicolaou se sigue utilizando hoy en día como cribado del cáncer de cuello de útero.
Técnicas para la evaluación del ciclo estral
Varios estudios han propuesto varios métodos para evaluar el ciclo estral basándose en los cambios en la fisiología y anatomía del animal. Estos métodos incluyen la evaluación visual, la citología vaginal, el examen histológico de los órganos reproductores, la impedancia de la pared vaginal y la bioquímica de la orina.
Evaluación visual
El método visual para evaluar el ciclo estral es ampliamente aceptado. Es no invasivo, simple, barato, rápido, menos estresante para los animales y los investigadores, y puede llevarse a cabo en cualquier lugar y en cualquier momento siempre que la iluminación sea adecuada. Este método es tan preciso y fiable como el frotis vaginal. Se ha informado de que es el método más rápido para determinar la fase de celo. Sin embargo, la mayoría de los estudios que informaron sobre este método utilizaron ratones; esto podría sugerir que esta técnica es más adecuada para animales pequeños como ratones y ratas. Los resultados de esta técnica también dependen del observador.
En la evaluación visual de la fase de estro, se debe sujetar el ratón con la mano no dominante y colocarlo en la sujeción con las patas delanteras apoyadas en una superficie, levantar la cola suavemente, y luego examinar y evaluar la vulva basándose en los criterios de Champlin et al. Es esencial disponer de una imagen digital para la documentación. También es importante evitar exámenes apresurados para evitar interpretaciones erróneas.
El aspecto de la vagina en las distintas fases del ciclo estral se resume en la Tabla 2. En la fase de proestro, la abertura vaginal aparece llena, hinchada y húmeda. Los tejidos son rosados, con estrías en los labios dorsales y ventrales de la vulva. En el estro, la vagina tiene un aspecto similar al del proestro, pero es menos rosada, menos hinchada y menos húmeda, con estrías más prominentes. En el metro, la abertura de la vagina es pálida y seca, con una capa de residuos celulares blancos. Las características del diestrus incluyen una abertura vaginal muy húmeda, que a veces es demasiado pequeña y cerrada en algunos ratones sin hinchazón del tejido (Figs. 1, 2 y 3).
Apariencia de la vagina en diferentes fases del ciclo estral de un ratón de la cepa albina suiza. a-Proestro, b-Estrus, c- Metestro, d- Diestrus (Ekambaram et al., )
Aspecto de la vagina en diferentes fases del ciclo estral de un ratón de la cepa agouti. a-Proestro, b-Estrus, c- Metestro, d- Diestrus (Byers et al., )
Aspecto de la vagina en diferentes fases del ciclo estral de un ratón de cepa no agouti. a-Proestro, b-Estrus, c- Metestro, d- Diestrus (Byers et al., )
Pintura vaginal/citología
De forma similar a la evaluación visual, la citología vaginal también es ampliamente aceptada. Parece ser la técnica más utilizada para determinar las fases del ciclo estral. No es invasiva y es relativamente barata. Aunque este método requiere cierta habilidad para el examen microscópico de las células de secreción vaginal, es preciso y fiable. Sin embargo, también se ha informado de que este método es tedioso y requiere mucho tiempo.
Durante la evaluación, se sujeta al animal y sus patas delanteras. Se eleva la cola para visualizar la vagina. Las células vaginales se lavan introduciendo suavemente una pequeña cantidad (100 μl) de agua destilada o solución salina utilizando una pipeta o una pera de látex estéril. La solución salina tamponada con fosfato puede ser un líquido alternativo. Suelte lentamente el líquido en la vagina y vuelva a introducirlo en la punta; esto debe repetirse unas 4 o 5 veces en la misma pera de látex estéril. Es esencial asegurarse de que la pipeta o la pera de látex estéril se coloque en la entrada del canal vaginal y no penetre en el orificio vaginal. El fluido que contiene algunas gotas de suspensión celular se introduce después en un portaobjetos de vidrio, se seca al aire y se tiñe. Puede utilizarse una tinción con violeta de cristal al 0,1% (0,1 g de polvo de violeta de cristal en 100 ml de agua bidestilada). Otras tinciones alternativas son las de tipo Romanowsky (como la de Wright modificada, la de Wright Giemsa) y la de azul de toluidina O . A continuación, el portaobjetos debe cubrirse con un cubreobjetos y examinarse inmediatamente con un microscopio de luz con 200 aumentos.
Alternativamente, puede obtenerse un hisopo vaginal utilizando un hisopo con punta de algodón humedecido con solución salina fisiológica a temperatura ambiente e introducido en la vagina del ratón sujeto. El hisopo debe girarse y rodarse suavemente contra la pared vaginal y luego retirarse. Las células recogidas se transfieren a un portaobjetos de vidrio seco moviendo el hisopo por el portaobjetos. El portaobjetos se seca al aire, se tiñe y se observa al microscopio.
La secreción vaginal está formada por tres tipos de células. Se trata de leucocitos, células epiteliales cornificadas y células epiteliales nucleadas. La estimación de la fase del ciclo estral se basa en la proporción de estas células en la secreción vaginal (Tabla 3 y Fig. 4).
Rueda del ciclo estral
La fase del proestro se caracteriza por la presencia de numerosas células redondas nucleadas de tamaño y aspecto uniforme. Aparecen en racimos o individualmente. También hay pocas células epiteliales cornificadas anucleadas. Algunos glóbulos blancos pueden estar presentes en la hembra en el proestro temprano (Fig. 5). La fase de estro muestra abundantes células epiteliales cornificadas anucleadas. El citoplasma es granular y las células tienen una forma irregular. También se observan numerosas bacterias y, ocasionalmente, células epiteliales nucleadas (Figs. 6 y 7). En el momento del metro, se observa un gran número de leucocitos y un pequeño número de células epiteliales grandes, no granulares y anucleadas. La formación del cuerpo lúteo, que no llega a luteinizar completamente debido a la falta de progesterona y que provoca el desprendimiento del revestimiento uterino, explica las células epiteliales cornificadas y los leucocitos polimorfonucleares presentes en los frotis vaginales. Algunas células epiteliales nucleadas también pueden estar presentes en el metro tardío (Figs. 8 y 9). En el diestro se observan prominentes leucocitos polimorfonucleares y unas pocas células epiteliales y cornificadas. Los leucocitos siguen siendo el tipo de célula predominante tras eliminar los restos celulares (Fig. 10).
Los frotis vaginales en proestro en ratas Sprague-Dawley
Los frotis vaginales en el celo en ratones
Los frotis vaginales en celo en ratas Sprague Dawley
Los frotis vaginales en el metrorrelato en ratones
Los frotis vaginales en el metrorrelato en ratas Sprague Dawley
Los frotis vaginales en el diestrus en ratones (a-e) y ratas Sprague Dawley (f)
Examen histológico de los órganos reproductores
Aunque la determinación de las fases del ciclo estral mediante esta técnica es muy fiable y precisa, tiene muchos inconvenientes. Esta técnica es invasiva y no es útil para la evaluación del estro en animales de laboratorio vivos. También es costosa y requiere una gran habilidad. Además, es demasiado tediosa y requiere mucho tiempo. Este método no es fácilmente disponible, por lo tanto no es factible particularmente en áreas remotas de la región tropical.
El requisito mínimo para la evaluación del ciclo estral por la histología es las secciones longitudinales completas de la vagina y de la cerviz, las secciones transversales de la porción media de ambos cuernos uterinos, y las secciones medias de ambos ovarios. La presencia de folículos ováricos no puede utilizarse para determinar la fase del estro en ratas y ratones con ciclos estrales cortos. Los folículos están casi siempre presentes en los ovarios en todas las fases. Sin embargo, la aparición de morfologías particulares del cuerpo lúteo puede ayudar en la estadificación aunque no sea definitiva . Los órganos extirpados se fijan con formol al 10%, se tiñen con hematoxilina y eosina y se examinan al microscopio.
La apariencia histológica de los órganos reproductores en las distintas fases del estro se muestra en la Tabla 4 y en las Figs. 11, 12, 13 y 14.
Impedancia de la pared vaginal
Aunque el uso de la impedancia eléctrica en la pared vaginal para determinar la fase del estro es controvertido y se cita raramente en la literatura, parece que está ganando más atención. Este método es conveniente, fácilmente disponible, y requiere menos habilidad. Es mucho menos susceptible de interpretación subjetiva por parte del operador técnico que la metodología de frotis vaginal más convencional. Sin embargo, también es caro y no está muy aceptado, posiblemente debido a su falta de fiabilidad. Esta técnica diferencia más bien los animales en celo de los que no lo están.
Un monitor de impedancia utilizado para esta técnica está compuesto por un medidor y una sonda vaginal (Fig. 15). Una persona sujeta al animal mientras otra persona introduce la sonda vaginal durante unos 30 s para tomar medidas de impedancia en la pantalla del medidor. La sonda se limpia con alcohol al 70% antes de cada análisis. Alternativamente, se puede emplear un medidor eléctrico sencillo, barato y portátil que funciona con pilas y que mide la resistencia en un amplio rango, el cual es comúnmente utilizado por los electricistas, tal y como lo describen Ramos et al. Cuando se utiliza este dispositivo alternativo, se le deben conectar cables fabricados a partir del cableado interno de un típico cable de audio apantallado de bajo costo, y se debe utilizar un terminal macho como sonda vaginal (Fig. 16).
Histología de los órganos reproductores de la rata en el proestro (West wood, 2008)
Histología de los órganos reproductores de la rata en el celo (West wood, 2008)
Histología de los órganos reproductores de la rata en el metrorrelato (Westwood, 2008)
Histología de los órganos reproductores de la rata en el diestrus (Westwood, 2008)
Un monitor de impedancia estándar
Terminal macho de un cable de audio estéreo estándar utilizado como sonda de medición de resistencia (Ramos et al, )
Los animales en celo tienen mayor impedancia vaginal que los que no están en fase de celo. Jaramillo et al. revelaron que el emparejamiento de una hembra con un macho basado en la impedancia de la pared vaginal resultó en mayores tasas de apareamiento confirmado así como de preñez cuando se comparó con el emparejamiento basado en el frotis vaginal. Por otra parte, Singletary et al. observaron que las ratas en fase de celo determinada por la citología vaginal tenían una impedancia vaginal más alta que las que no estaban en celo, pero la impedancia vaginal y la fase del ciclo estral determinada por la citología vaginal no se correlacionaban. La mayoría de los autores que documentaron el uso de la impedancia de la pared vaginal verificaron sus hallazgos con la citología vaginal; por lo tanto, no se ha informado de ningún valor de referencia para indicar si un animal está o no en celo.
Bioquímica de la orina
Aunque este método de evaluación del estro aún no ha ganado popularidad y aceptación universal, es una herramienta útil. Esta técnica es sencilla, relativamente barata y no es tediosa. Dado que los niveles de carbohidratos, proteínas y ácidos grasos en la orina suelen responder al estradiol y a la progesterona, esto podría variar entre especies y cepas. Este método es inespecífico y poco fiable, ya que algunos animales tienen niveles elevados y constantes de proteínas en la orina, que sirven como señales químicas en estos animales.
Durante la evaluación, el animal de experimentación debe ser sostenido sobre un vidrio de reloj, y se aplica un suave masaje abdominal para estimular la micción. La muestra de orina se recoge y se tamiza a través de una estopilla o malla de nylon (16-120 μm) en el momento de la recogida. La muestra debe conservarse a – 20 °C si no se analiza inmediatamente. Los hidratos de carbono, las proteínas y los lípidos/ácidos grasos de la orina deben analizarse utilizando métodos estándar.
Los niveles de proteínas y lípidos de la orina son significativamente mayores en las fases de proestro y estro. La concentración de ácidos grasos en la orina también es muy superior en el celo. El nivel de carbohidratos en la orina es similar a lo largo del ciclo estral . Al igual que la impedancia de la pared vaginal, no hay ningún informe de valores estándar para la bioquímica de la orina en cada fase del ciclo estral para los animales de laboratorio comúnmente utilizados.
Inducción del celo
Cuando se evalúa el comportamiento sexual, particularmente en los animales machos, o los potenciales afrodisíacos de un agente/fármaco particular, es esencial llevar a las hembras al celo (fase)/calor artificial. Esto aumenta su receptividad y disposición a aparearse con los machos. Esta práctica es habitual en la cría de animales. Se consigue administrando una suspensión de etinilestradiol a 100 μg/animal por vía oral 48 horas antes del emparejamiento con el macho y progesterona a 1 mg/animal por vía subcutánea 6 horas antes del emparejamiento. Alternativamente, el benzoato de estradiol a 10 μg/100 g de peso corporal y la progesterona a 0,5 mg/100 g de peso corporal se administran por vía subcutánea 48 h y 4-6 h respectivamente antes del emparejamiento (Tabla 5). La fase de celo se confirma habitualmente mediante frotis vaginal. Una combinación de evaluación visual con frotis vaginal puede establecer el estro. La confirmación de la fase de estro de la hembra inducida se realiza mediante la evaluación de su receptividad. Esto se hace exponiéndolas a un macho homólogo (no utilizado para el estudio) antes del experimento/prueba. A las hembras con máxima receptividad se les permite aparearse.