Cabrillo se embarcó de joven hacia La Habana y se unió a Hernán Cortés en México (entonces llamada Nueva España). Más tarde, su éxito en la extracción de oro en Guatemala le convirtió en uno de los más ricos de los conquistadores en México. Según su biógrafo Harry Kelsey, tomó a una indígena como esposa de hecho y tuvo varios hijos, entre ellos al menos tres hijas. Más tarde se casó con Beatriz Sánchez de Ortega en Sevilla durante un paréntesis en España. Ella regresó a Guatemala con él y le dio dos hijos.
Cabrillo se benefició del sistema de encomiendas que esclavizaba a los pueblos indígenas de América. En Honduras, por ejemplo, disolvió las familias, enviando a los hombres a las minas en busca de oro y a la selva a recoger los materiales que necesitaba para la construcción de barcos. Acompañó a Francisco de Orozco a someter a los indígenas mixtecos en lo que acabaría siendo la ciudad de Oaxaca, en México. Poco se sabe de lo que Cabrillo hizo allí.
En 1539, Francisco de Ulloa, que había sido comisionado por Cortés, descubrió el Golfo de California y llegó casi hasta el paralelo 30 al norte. Cabrillo recibió entonces el encargo del nuevo virrey de Nueva España, Antonio de Mendoza, de dirigir una expedición por la costa del Pacífico en busca de oportunidades comerciales, tal vez para encontrar un camino hacia China (pues se desconocía toda la extensión del Pacífico norte) o para encontrar el mítico Estrecho de Anián (o Paso del Noroeste) que conectaba el Océano Pacífico con la Bahía de Hudson. Cabrillo construyó y fue propietario del buque insignia de su empresa (dos o tres barcos), y se benefició de cualquier comercio o tesoro.
En 1540, la flota zarpó de Acajutla, El Salvador, y llegó a Navidad, México, el día de Navidad. Durante su estancia en México, Pedro de Alvarado acudió en ayuda de la ciudad de Nochistlán, que estaba sitiada por nativos hostiles, y murió cuando su caballo cayó sobre él, aplastándole el pecho. Tras la muerte de Alvarado, el virrey tomó posesión de la flota de Alvarado. Parte de la flota fue enviada a las Islas Filipinas bajo el mando de Ruy López de Villalobos y dos de los barcos fueron enviados al norte bajo el mando de Cabrillo.
El 27 de junio de 1542, Cabrillo partió de Navidad con tres barcos: el galeón y buque insignia San Salvador, de 200 toneladas, el más pequeño La Victoria (c. 100 toneladas), y la fragata o bergantín San Miguel, de veintiséis velas. El 1 de agosto, Cabrillo ancló a la vista de la isla de Cedros. Antes de que terminara el mes habían pasado la punta de Baja (llamada «Cabo del Engaño» por de Ulloa en 1539) y entrado en «aguas desconocidas, donde ningún barco español había estado antes». El 28 de septiembre desembarcó en la actual bahía de San Diego y la llamó «San Miguel». Poco más de una semana después llegó a la isla de Santa Catalina (7 de octubre), a la que llamó «San Salvador», en honor a su buque insignia. Al enviar una embarcación a la isla «apareció una gran multitud de indios armados», de los que, sin embargo, se hizo «amigo» más tarde. La cercana isla de San Clemente fue bautizada como «Victoria», en honor al tercer barco de la flota. A la mañana siguiente, el 8 de octubre, Cabrillo llegó a la Bahía de San Pedro, que fue bautizada como «Baya de los Fumos». Al día siguiente anclaron durante la noche en la bahía de Santa Mónica. Subiendo por la costa Cabrillo vio la isla de Anacapa, que según supieron por los indios estaba deshabitada.
La flota pasó la siguiente semana en las islas, principalmente anclada en Cuyler Harbor, una bahía en la costa noreste de la isla de San Miguel. El 18 de octubre la expedición divisó Point Conception, al que llamaron «Cabo de Galera».La expedición de Cabrillo registró en octubre de 1542 los nombres de numerosos pueblos chumash en la costa de California y las islas adyacentes, situados entonces en las dos provincias en guerra de Xexo (gobernada por una «vieja», actual condado de Santa Bárbara, California) y Xucu (actual condado de Ventura, California).
El 13 de noviembre avistaron y bautizaron el «Cabo de Piños» (posiblemente Point Pinos o Point Reyes), pero pasaron por alto la entrada de la bahía de San Francisco, un error que los navegantes repetirían durante los dos siglos siguientes y más, muy probablemente porque su entrada está frecuentemente cubierta por la niebla. Es posible que la expedición llegara hasta el norte, al río Ruso o incluso al Columbia, antes de que las tormentas otoñales les obligaran a dar la vuelta. Debido a la vaguedad de su descripción, no se sabe con certeza qué río del norte avistó la expedición. Volviendo a bajar por la costa, Cabrillo entró en la Bahía de Monterrey, bautizándola como «Bahía de Los Piños».
El 23 de noviembre de 1542, la pequeña flota llegó de nuevo a «San Salvador» (Isla de Santa Catalina) para pasar el invierno y hacer reparaciones. Allí, en torno a la Nochebuena, Cabrillo salió de su barco y se astilló la espinilla al tropezar con una roca irregular mientras intentaba rescatar a algunos de sus hombres del ataque de los guerreros Tongva. La herida se infectó y desarrolló gangrena, y murió el 3 de enero de 1543 y fue enterrado. Posteriormente se encontró una posible lápida en la isla de San Miguel. Su segundo al mando llevó al resto del grupo de vuelta a Navidad, donde llegaron el 14 de abril de 1543.
El informe oficial notarial de la expedición de Cabrillo se perdió; todo lo que sobrevive es un resumen del mismo realizado por otro investigador, Andrés de Urdaneta, que también tuvo acceso a los diarios de navegación y a las cartas de navegación. Ningún relato impreso del viaje de Cabrillo apareció antes del relato del historiador Antonio de Herrera a principios del siglo XVII.