Tecnologías de tipificación de repeticiones cortas en tándem utilizadas en las pruebas de identidad humana

Tabla 1. Características de los 15 loci STR presentes en el kit comercial AmpFlSTR Identifiler

Con la tipificación de STR, la PCR se utiliza para recuperar información de pequeñas cantidades de material biológico disponible. Los tamaños relativamente cortos de los productos de la PCR, de aproximadamente 100-500 pb, generados con las pruebas de STR suelen ser compatibles con el ADN degradado que puede estar presente debido a las agresiones ambientales en el material biológico probatorio encontrado en la escena del crimen. La amplificación por PCR de varios loci de STR simultáneamente, o multiplexación, es posible con tintes fluorescentes de diferentes colores y productos de PCR de diferentes tamaños. El uso de múltiples loci permite un alto poder de discriminación en una sola prueba sin consumir mucho ADN (por ejemplo, 1 ng o menos de material de partida). Cabe destacar que estos loci STR centrales se encuentran entre los genes en los que se tolera un alto grado de variabilidad y, por tanto, no son directamente responsables de rasgos físicos como el color del pelo o de los ojos o de enfermedades genéticas.

Kits comerciales

Los kits comerciales, que proporcionan cebadores premezclados y una mezcla maestra estándar que contiene la polimerasa, los tampones enzimáticos y los dNTP, simplifican la generación de perfiles de STR y proporcionan resultados sobre un conjunto uniforme de loci de STR básicos para hacer posible el intercambio nacional e internacional de perfiles de ADN criminal. En la mayoría de los laboratorios forenses se prefieren los kits comerciales a los ensayos internos, aunque sean más caros, ya que ayudan a simplificar y estandarizar los procedimientos y eliminan la carga del control de calidad de los componentes de la PCR del ocupado usuario final. Además, los kits de STR suministran escalas alélicas que contienen alelos de STR comunes que han sido previamente caracterizados para el número de unidades de repetición mediante la secuenciación del ADN. Estas escalas alélicas se utilizan para calibrar los tamaños de los productos de PCR con el número de repeticiones de STR con fines de genotipado. La Figura 1 muestra la escalera alélica del ampliamente utilizado kit AmpFlSTR Identifiler (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) (3) que contiene 205 alelos a través de 16 loci coamplificados -15 STRs- más un ensayo de tipificación del sexo de la amelogenina.

El proceso completo de tipificación de STR incluye la recogida de muestras, la extracción de ADN, la cuantificación del ADN, la amplificación por PCR de múltiples loci de STR, la separación y el dimensionamiento de los alelos de STR, la tipificación de STR y la interpretación del perfil, y un informe de la importancia estadística de una coincidencia (si se observa). En muchas situaciones de trabajo de casos, como las pruebas de agresión sexual, las mezclas de ADN pueden ser el resultado de una combinación de fluidos corporales de la víctima y del agresor y crear un resultado complejo y difícil de interpretar.

Separaciones de ADN

Después de la amplificación por PCR, se mide la longitud total del amplicón de STR para determinar el número de repeticiones presentes en cada alelo encontrado en el perfil de ADN. Esta medición de la longitud se realiza a través de una separación basada en el tamaño que implica el gel o la electroforesis capilar (CE). Cada amplicón de STR ha sido marcado con fluorescencia durante la PCR, ya que el cebador específico del locus delantero o inverso contiene un tinte fluorescente. Así, registrando el color del tinte y el tiempo de migración de cada fragmento de ADN en relación con un estándar de tamaño interno, se puede determinar el tamaño de cada alelo de STR tras su separación de otros alelos de STR. Los instrumentos comúnmente utilizados para la separación y el dimensionamiento de alelos de STR incluyen los analizadores genéticos ABI PRISM 310 y ABI PRISM 3100 (Applied Biosystems) (4).

Hay una serie de artefactos tanto biológicos como instrumentales que a menudo deben ser clasificados para generar un perfil de STR completo y preciso (5; véase también la Referencia 1, Capítulos 6 y 15). Los artefactos biológicos incluyen productos de tartamudeo, picos divididos por adenilación incompleta, patrones trialélicos y alelos variantes que contienen mutaciones en las regiones de repetición o flanqueo que hacen que un alelo esté fuera de la escalera. Los artefactos instrumentales surgen de los picos de voltaje, las manchas de tinte y el sangrado entre los colores del tinte.

Aunque la instrumentación de CE de detección de fluorescencia multicolor, como el analizador genético ABI PRISM 3100, domina actualmente el campo, se están realizando esfuerzos para desarrollar plataformas de CE de microchip (6) para realizar separaciones de ADN de alta resolución con la eventual integración de la amplificación de PCR y las separaciones de CE (7). Además, se han utilizado técnicas de espectrometría de masas (EM) con desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI) y de ionización por electrospray (ESI) para la tipificación de STR sin escalas alélicas (8,9).

miniSTRs: Recuperación de la información del ADN degradado

Las moléculas de ADN que se exponen al agua y/o al calor, con el tiempo, comenzarán a descomponerse en trozos más pequeños. Varios estudios han demostrado lo que se predice teóricamente: que los tipos de ADN pueden recuperarse más eficazmente de las muestras de ADN degradado cuando los productos de PCR son más pequeños (10-12). Moviendo los cebadores de la PCR más cerca de la región de repetición del STR, los tamaños de los productos pueden reducirse conservando la misma información (11). La utilidad de los ensayos miniSTR se ha confirmado en estudios intra e interlaboratorios con muestras óseas degradadas y manchas de sangre y saliva envejecidas (12). Las tasas de éxito en la recuperación de información de muestras de ADN comprometidas mejoran con los sistemas miniSTR en comparación con los kits de STR convencionales. Se puede encontrar una línea de tiempo que cubre el desarrollo de los miniSTRs en www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/miniSTR/timeline.htm.

Usando su química de 5 tintes y la tecnología de modificadores de movilidad, Applied Biosystems ha desarrollado un kit de miniSTR capaz de amplificar ocho loci de STR básicos y amelogenina con tamaños de producto de PCR reducidos en relación con los kits comerciales actuales. Este kit AmpFlSTR MiniFiler, que incluye una mezcla maestra de PCR mejorada, debería ayudar a recuperar los resultados de las muestras de ADN degradadas. Sin embargo, es importante tener en cuenta que debido a que se utilizan diferentes cebadores de PCR con el kit miniSTR en relación con los kits de STR anteriores, pueden producirse resultados discordantes debido a las mutaciones del sitio de unión del cebador que causan la caída del alelo.

Prueba de concordancia

Algunos alelos de STR contienen variación de la secuencia en las regiones flanqueantes. Si se produce un cambio de nucleótidos (o una inserción o supresión) en un sitio de unión del cebador de PCR en un alelo particular, es posible que la secuencia mutante sea incompatible con el recocido del cebador y que el alelo variante no se amplifique (1). Este abandono alélico se denomina a veces alelo nulo. Una muestra que en realidad es un heterocigoto puede aparecer como un aparente homocigoto si los cebadores de la PCR no consiguen anillarse y amplificar el alelo que contiene la mutación puntual (Figura 2). En algunos casos, el alelo nulo puede recuperarse reduciendo la temperatura de recocido, lo que permite una unión menos estricta entre el cebador y la plantilla de ADN. Un estudio de concordancia, en el que se analiza un conjunto de las mismas muestras de ADN con cebadores de PCR que no se solapan, permite la detección de alelos nulos. Un examen de MiniFiler frente a Identifiler sólo encontró 27 discrepancias en más de 10.000 genotipos comparados (13). Un resumen de los resultados discordantes observados en los estudios de concordancia está disponible en www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/NullAlleles.htm.

Si se utilizan los mismos cebadores de PCR, se pueden esperar resultados idénticos de tipificación de STR en la misma muestra de ADN. Sin embargo, si se cambian las posiciones de los cebadores, existe la posibilidad de que se produzcan abandonos de alelos o cambios de tamaño. En algunos casos, los cebadores adicionales que coinciden con el alelo mutante -a menudo denominados cebadores degenerados- pueden incluirse en la mezcla de cebadores del kit para permitir la recuperación de la amplificación de la PCR cuando el alelo variante que contiene un desajuste en el sitio de unión del cebador está presente (14).

Perspectivas sobre el futuro

Como señaló hace casi 7 años el Grupo de Trabajo de Investigación y Desarrollo de la Comisión Nacional sobre el Futuro de las Pruebas de ADN (15), los STRs serán probablemente los marcadores de elección en el futuro inmediato debido a su uso generalizado en las bases de datos nacionales de ADN (2,16,17). Es probable que veamos una progresión evolutiva en la tecnología de tipificación, métodos de amplificación más rápidos, kits de STR adicionales que contengan nuevos loci y programas informáticos que permitan una evaluación rápida de los datos de tipificación de STR. Gracias a los continuos avances, las tecnologías de tipificación de STR podrán miniaturizarse e integrarse con otras partes del proceso, como la extracción y la amplificación del ADN. En la actualidad se están construyendo bases de datos de ADN eficaces y se están resolviendo numerosos casos forenses mediante la generación de perfiles de STR con un conjunto común de marcadores genéticos. Estos loci centrales actuales han desempeñado y seguirán desempeñando un papel vital en las pruebas de identidad humana.