El aislamiento conductual es un mecanismo común y potente de aislamiento reproductivo. Determinar hasta qué punto el aislamiento conductual varía con las condiciones ambientales es fundamental para entender la especiación y el mantenimiento de los límites de las especies. En este trabajo se analizó el efecto de la salinidad sobre el aislamiento conductual (reconocimiento de la especie por parte de las hembras, competencia entre machos y reconocimiento de la especie por parte de los machos) entre dos killis estrechamente relacionados (Lucania goodei y L. parva) que difieren en la tolerancia a la salinidad. Realizamos ensayos de no elección y pruebas de comportamiento en las que los machos podían competir y cortejar a las hembras en agua dulce (0 ppt) y salobre (15 ppt). Encontramos altos niveles de aislamiento conductual que no variaron en función de la salinidad. En las pruebas de comportamiento, el reconocimiento de las hembras por parte de los machos fue fuerte y asimétrico entre las dos especies. Los machos de Lucania goodei preferían a los congéneres y rara vez cortejaban o se apareaban con las hembras de L. parva. Los machos de Lucania parva prefieren a los congéneres pero cortejan y se aparean fácilmente con las hembras de L. goodei. Esta asimetría coincide con asimetrías previamente documentadas en la aptitud de la descendencia híbrida. Los cruces entre los machos de L. parva y las hembras de L. goodei producen híbridos totalmente viables y fértiles, pero los cruces entre los machos de L. goodei y las hembras de L. parva producen machos con una fertilidad reducida. Por lo tanto, el aislamiento conductual puede haber evolucionado en parte debido al refuerzo.