Quando una molecola di DNA è a doppio filamento, come il DNA di solito è, i due filamenti corrono in direzioni opposte. Pertanto, un’estremità della molecola avrà l’estremità 3′ del filamento 1 e l’estremità 5′ del filamento 2, e viceversa nell’altra estremità. Tuttavia, il fatto che la molecola sia a due filamenti permette numerose variazioni diverse.
Estremità smussateModifica
La più semplice estremità del DNA di una molecola a doppio filamento è chiamata estremità smussata. Le estremità smussate sono anche conosciute come estremità non coesive. In una molecola blunt-ended, entrambi i filamenti terminano in una coppia di basi. Le estremità smussate non sono sempre desiderate nelle biotecnologie poiché quando si usa una DNA ligasi per unire due molecole in una, la resa è significativamente inferiore con le estremità smussate. Quando si esegue il subclonaggio, ha anche lo svantaggio di inserire potenzialmente il DNA inserito nell’orientamento opposto desiderato. D’altra parte, le estremità smussate sono sempre compatibili tra loro. Ecco un esempio di un piccolo pezzo di DNA con estremità smussate:
5'-GATCTGACTGATGCGTATGCTAGT-3'3'-CTAGACTGACTACGCATACGATCA-5'
Overhangs e sticky endsModifica
Le estremità non smussate sono create da vari overhangs. Un overhang è un tratto di nucleotidi non appaiati alla fine di una molecola di DNA. Questi nucleotidi non appaiati possono essere in entrambi i filamenti, creando una sporgenza di 3′ o 5′. Nella maggior parte dei casi, queste sporgenze sono palindromiche.
Il caso più semplice di una sporgenza è un singolo nucleotide. Questo è più spesso l’adenosina e viene creato come un overhang 3′ da alcune DNA polimerasi. Più comunemente questo è usato nel clonare prodotti PCR creati da un tale enzima. Il prodotto è unito con una molecola di DNA lineare con una sporgenza di timina 3′. Poiché l’adenina e la timina formano una coppia di basi, questo facilita l’unione delle due molecole da parte di una ligasi, producendo una molecola circolare. Ecco un esempio di una A-overhang:
5'-ATCTGACTA-3'3'-TAGACTGA-5'
Le overhang più lunghe sono chiamate estremità coesive o sticky ends. Sono più spesso create dalle endonucleasi di restrizione quando tagliano il DNA. Molto spesso tagliano i due filamenti di DNA a quattro coppie di basi l’uno dall’altro, creando una sporgenza di quattro basi 5′ in una molecola e una sporgenza 5′ complementare nell’altra. Queste estremità sono chiamate coesive perché sono facilmente riunite da una ligasi.
Per esempio, queste due estremità “appiccicose” sono compatibili:
5'-ATCTGACT + GATGCGTATGCT-3'3'-TAGACTGACTACG CATACGA-5'
Possono formare coppie di basi complementari nella regione dell’overhang:
GATGCGTATGCT-3'5'-ATCTGACT CATACGA-5'3'-TAGACTGACTACG
Inoltre, dato che diverse endonucleasi di restrizione di solito creano diversi overhang, è possibile creare un plasmide escindendo un pezzo di DNA (usando un enzima diverso per ogni estremità) e poi unendolo ad un’altra molecola di DNA con le estremità tagliate dagli stessi enzimi. Poiché le sporgenze devono essere complementari perché la ligasi funzioni, le due molecole possono unirsi solo in un orientamento. Questo è spesso altamente desiderabile in biologia molecolare.
Frayed endsEdit
A partire da ogni singolo filamento di DNA, vediamo tipicamente l’adenina accoppiarsi con la timina, e la citosina accoppiarsi con la guanina per formare un filamento complementare parallelo come descritto sotto. Due sequenze nucleotidiche che si corrispondono in questo modo sono dette complementari:
5'-ATCTGACT-3'3'-TAGACTGA-5'
Un’estremità sfrangiata si riferisce a una regione di una molecola di DNA a doppio filamento (o altri filamenti multipli) vicino alla fine con una proporzione significativa di sequenze non complementari; cioè, una sequenza in cui i nucleotidi sui filamenti adiacenti non corrispondono correttamente:
5'-ATCTGACTAGGCA-3'3'-TAGACTGACTACG-5'
Il termine “sfrangiato” è usato perché i nucleotidi non correttamente abbinati tendono ad evitare di legarsi, apparendo così simili ai fili di una corda che si sfilaccia.
Anche se sequenze non complementari sono possibili anche nel mezzo del DNA a doppio filamento, le regioni non corrispondenti lontane dalle estremità non vengono definite “sfilacciate”.