Cabrillo si imbarcò da giovane per l’Avana e si unì a Hernán Cortés in Messico (allora chiamato Nuova Spagna). Più tardi, il suo successo nell’estrazione dell’oro in Guatemala lo renderà uno dei più ricchi tra i conquistadores del Messico. Secondo il suo biografo Harry Kelsey, prese una donna indigena come moglie di diritto e generò diversi figli, tra cui almeno tre femmine. Più tardi sposò Beatriz Sanchez de Ortega a Siviglia durante una pausa in Spagna. Lei tornò in Guatemala con lui e gli diede due figli.
Cabrillo beneficiò del sistema di encomienda che schiavizzava i popoli nativi delle Americhe. In Honduras, per esempio, spezzò le famiglie, mandando gli uomini nelle miniere per l’oro e nella foresta per raccogliere i materiali necessari alla costruzione delle navi. Le donne e le ragazze le consegnò ai suoi soldati e marinai, presumibilmente come schiavi.
Accompagnò Francisco de Orozco a sottomettere gli indigeni Mixtec in quella che sarebbe poi diventata la città di Oaxaca, in Messico. Nel 1539 Francisco de Ulloa, che aveva ricevuto l’incarico da Cortés, scoprì il Golfo della California e arrivò quasi fino al 30° parallelo. Cabrillo fu quindi incaricato dal nuovo viceré della Nuova Spagna, Antonio de Mendoza, di guidare una spedizione lungo la costa del Pacifico in cerca di opportunità commerciali, forse per trovare una via verso la Cina (poiché l’intera estensione del Pacifico settentrionale era sconosciuta) o per trovare il mitico Stretto di Anián (o Passaggio a Nord-Ovest) che collega l’Oceano Pacifico con la Baia di Hudson. Cabrillo costruì e possedette l’ammiraglia della sua impresa (due o tre navi), e si mise in testa di trarre profitto da qualsiasi commercio o tesoro.
Nel 1540, la flotta salpò da Acajutla, El Salvador, e raggiunse Navidad, Messico, il giorno di Natale. Mentre si trovava in Messico, Pedro de Alvarado andò in soccorso della città di Nochistlán, assediata da indigeni ostili, e rimase ucciso quando il suo cavallo gli cadde addosso, schiacciandogli il petto. Dopo la morte di Alvarado, il viceré prese possesso della flotta di Alvarado. Una parte della flotta fu inviata alle Isole Filippine sotto Ruy López de Villalobos e due delle navi furono inviate a nord sotto il comando di Cabrillo.
Il 27 giugno 1542, Cabrillo partì da Navidad con tre navi: il galeone e nave ammiraglia San Salvador di 200 tonnellate, la più piccola La Victoria (circa 100 tonnellate), e la “fragata” o “bergantin” San Miguel, armata con ventisei remi. Il primo agosto, Cabrillo si ancorò in vista dell’isola Cedros. Prima della fine del mese avevano superato la Punta Baja (chiamata “Cabo del Engaño” da de Ulloa nel 1539) ed erano entrati in “acque inesplorate, dove nessuna nave spagnola era stata prima”. Il 28 settembre sbarcò in quella che oggi è la baia di San Diego e la chiamò “San Miguel”. Poco più di una settimana dopo raggiunse l’isola di Santa Catalina (7 ottobre), che chiamò “San Salvador”, come la sua nave ammiraglia. Mandando una barca sull’isola “apparve una grande folla di indiani armati” – con i quali, tuttavia, più tardi “fecero amicizia”. La vicina isola di San Clemente fu chiamata “Victoria”, in onore della terza nave della flotta. La mattina dopo, l’8 ottobre, Cabrillo arrivò alla baia di San Pedro, che fu chiamata “Baya de los Fumos” (in inglese: Smoke Bay). Il giorno seguente si ancorarono per la notte nella baia di Santa Monica. Risalendo la costa Cabrillo vide l’isola di Anacapa, che appresero dagli indiani essere disabitata.
La flotta trascorse la settimana successiva nelle isole, per lo più ancorata nel porto di Cuyler, una baia sulla costa nord-orientale dell’isola di San Miguel. Il 18 ottobre la spedizione vide Point Conception, che chiamò “Cabo de Galera”.La spedizione di Cabrillo registrò nell’ottobre 1542 i nomi di numerosi villaggi Chumash sulla costa della California e sulle isole adiacenti – allora situati nelle due province in guerra di Xexo (governata da una “vecchia donna”, oggi contea di Santa Barbara, California) e Xucu (oggi contea di Ventura, California).
Il 13 novembre avvistarono e chiamarono “Cabo de Piños” (forse Point Pinos o Point Reyes), ma mancarono l’entrata della baia di San Francisco, un errore che i navigatori avrebbero ripetuto per i successivi due secoli e più, molto probabilmente perché la sua entrata è spesso avvolta dalla nebbia. La spedizione potrebbe aver raggiunto il nord fino al Russian River o addirittura il Columbia prima che le tempeste autunnali li costringessero a tornare indietro. A causa della vaghezza della sua descrizione, è incerto quale fiume settentrionale la spedizione abbia avvistato. Scendendo lungo la costa, Cabrillo entrò nella baia di Monterey, chiamandola “Bahia de Los Piños”.
Il 23 novembre 1542, la piccola flotta arrivò di nuovo a “San Salvador” (Santa Catalina Island) per svernare e fare riparazioni. Lì, verso la vigilia di Natale, Cabrillo uscì dalla sua barca e si scheggiò la tibia quando inciampò su una roccia frastagliata mentre cercava di salvare alcuni dei suoi uomini dagli attacchi dei guerrieri Tongva. La ferita si infettò e sviluppò la cancrena, e morì il 3 gennaio 1543 e fu sepolto. Una possibile lapide fu trovata più tardi sull’isola di San Miguel. Il suo secondo in comando riportò il resto del gruppo a Navidad, dove arrivarono il 14 aprile 1543.
Il rapporto ufficiale della spedizione di Cabrillo è andato perduto; tutto ciò che sopravvive è un riassunto fatto da un altro investigatore, Andrés de Urdaneta, che aveva anche accesso ai giornali di bordo e alle carte nautiche. Nessun resoconto stampato del viaggio di Cabrillo apparve prima del resoconto dello storico Antonio de Herrera all’inizio del XVII secolo.