High-Throughput Advances for Chronological Life Span and New Attention for Quiescent Cells
CLS in S. cerevisiae e S. pombe usa saggi simili per determinare quanto tempo le cellule possono sopravvivere in coltura liquida dopo che il glucosio e vari altri nutrienti sono stati esauriti (Longo et al, 2012; Chen e Runge, 2009, 2012; Fabrizio e Longo, 2003; Zuin et al., 2008, 2010). Poiché le cellule si arrestano per fame, il rilevamento dei nutrienti e la degradazione dei componenti proteici interni da parte dell’autofagia svolgono ruoli importanti nella CLS (Sideri et al., 2014; Yamaguchi e Otsu, 2012; Alvers et al., 2009a,b; Aris et al., 2012, 2013). La progettazione di saggi CLS richiedono che alcuni punti chiave da tenere a mente. In primo luogo, se il saggio CLS deve essere un modello per altri organismi, allora il saggio dovrebbe avere gli stessi effetti sul lievito che il saggio analogo ha su altri modelli. Per la maggior parte degli organismi, queste caratteristiche includono l’estensione della durata della vita mediante restrizione calorica, e queste cellule longeve sono spesso resistenti allo stress (per esempio, Fabrizio et al., 2001). Mentre le condizioni sono state stabilite per S. cerevisiae molto tempo fa, il principale mezzo sintetico utilizzato nel campo di S. pombe, chiamato Edinburgh Minimal Medium (EMM o EMM2), non ricapitola queste caratteristiche conservate di durata della vita e restrizione calorica (Chen e Runge, 2009). Invece, S. pombe richiede o un ricco mezzo YES (estratto di lievito (YE) e integratori (S) e fonte di carbonio) o un mezzo chiamato SD (un mezzo sintetico chimicamente derivato (S) più destrosio (D)) con diversi livelli di componenti rispetto a EMM (Chen e Runge, 2009; Zuin et al., 2010). In secondo luogo, il saggio dovrebbe incorporare informazioni sull’organismo modello. S. cerevisiae e S. pombe possono far crescere rapidamente intere popolazioni da una singola cellula, cosa che non può essere fatta con gli esseri umani o i topi. I lieviti, quindi, possono regolare i loro macchinari di base in modo diverso quando la maggior parte delle cellule nella cultura muore (ad esempio, passando da ∼108 a 10 cellule/mL) rispetto a quando il numero di cellule scende all’1% del livello originale (da ∼108 a 106 cellule/mL). Infatti, S. cerevisiae si comporta in modo complesso in un saggio CLS, poiché quando le cellule scendono a ∼0,1% della densità originale di cellule vive per ml in un saggio CLS, una frazione di cellule inizierà a ricrescere (Fabrizio et al., 2004) (Fig. 30.2B). Le cellule si avvelenano anche da sole secernendo piccoli acidi organici (per esempio, acido acetico) nel mezzo (Burtner et al., 2009). Questo comportamento complesso richiede che la maggior parte dei saggi CLS di S. cerevisiae non vada molto oltre una perdita di vitalità inferiore all’1%. Al contrario, il saggio CLS di S. pombe può mostrare un calo di vitalità di 5-6 ordini di grandezza senza ricrescita, il che permette di isolare più facilmente le cellule longeve (Chen e Runge, 2009; Chen et al., 2013).
Sia S. cerevisiae che S. pombe sono stati utilizzati per lo screening dei rispettivi ceppi di delezione a livello genomico per mutanti con CLS esteso. Ogni delezione genica è contrassegnata da una sequenza unica di DNA o codice a barre. Questi saggi CLS hanno incluso la sopravvivenza in piastre di microtitolazione (Powers et al., 2006) o il saggio standard utilizzando i codici a barre associati alle delezioni per identificare i mutanti associati a diverse durate di vita. Le frequenze dei codici a barre sono state determinate utilizzando l’ibridazione di microarray (Wei et al., 2008) o approcci di sequenziamento dei codici a barre (Chen et al., 2013; Sideri et al., 2014). Sono stati identificati anche altri geni che estendono il CLS in sovraespressione (Ohtsuka et al., 2009; Miwa et al., 2011). Mentre l’elenco dei geni che hanno regolato la durata della vita non sarà rivisto qui, è importante notare che TOR è emerso come un importante regolatore della durata della vita in entrambi i lieviti (Powers et al., 2006; Wei et al., 2008; Sideri et al., 2014). In generale, i saggi CLS standard hanno fornito una grande quantità di informazioni che evidenziano l’importanza di un insieme di vie evolutivamente conservate che controllano l’invecchiamento (Longo et al., 2012).
I risultati dei saggi CLS presentano alcuni enigmi. Perché le S. cerevisiae sono così variabili alla fine del CLS? Perché S. pombe hanno un CLS così breve (14 giorni)? Mentre le risposte a queste domande non sono note, una possibilità è che i saggi manchino di caratteristiche evolutive non apprezzate in entrambe le specie. Una di queste caratteristiche che di solito non viene considerata è un altro stato differenziato del lievito che si verifica nei saggi CLS, la cellula G0 quiescente o cellula Q.
Quando S. cerevisiae cresce fino alla saturazione e rimane in coltura, una frazione di cellule si differenzia in cellule piccole e dense che possono essere isolate dal resto della popolazione (Allen et al., 2006) (Fig. 30.2D). Studi più recenti hanno dimostrato che le cellule Q possono essere smistate lontano dalle altre cellule tramite il fluorescence-activated cell sorting per l’analisi (Miles e Breeden, 2017). Queste cellule hanno proprietà notevoli in termini di CLS. Possono sopravvivere per quasi 1 anno in acqua, sono altamente resistenti allo stress e rientrano sincronicamente nel ciclo cellulare quando vengono aggiunti loro dei nutrienti (Allen et al., 2006; Miles e Breeden, 2017). Il fatto che si formino pochi giorni dopo l’inizio di una CLS indica che probabilmente svolgono un ruolo nell’analisi delle cellule CLS. Se l’ormai apprezzata presenza di cellule Q nei saggi CLS di S. cerevisiae faccia qualche differenza con le precedenti conclusioni tratte da essi non è attualmente chiaro. Il laboratorio Breeden ha analizzato intensamente le cellule Q di S. cerevisiae negli ultimi anni, ed è stato dimostrato che i repressori trascrizionali e i rimodellatori della cromatina (ad esempio, Xbp1 e Rpd3) svolgono ruoli chiave in questo processo (Miles e Breeden, 2017; Miles et al., 2013; McKnight et al., 2015). Proteine note per svolgere ruoli nella transizione G1/S del ciclo cellulare hanno anche ruoli nella transizione alla quiescenza (ad esempio, il complesso di trascrizione SBF), e questi complessi centrali sono adattati all’induzione della quiescenza dall’acquisizione di altri fattori (ad esempio, Msa1 e Msa2) (Miles et al., 2016). Quindi, sfruttando le informazioni provenienti dalle cellule in bicicletta, il macchinario cellulare di base che governa l’entrata in G0 è stato chiarito. Poiché l’identificazione di tali macchinari di base è uno dei principali obiettivi della ricerca sull’invecchiamento, questo lavoro rappresenta un importante passo avanti. Un importante sforzo futuro richiederà di determinare quali altri processi cellulari queste vie conservate controllano.
La quiescenza in S. pombe è un po’ diversa. Quando S. pombe si accoppia in laboratorio, due cellule di tipo opposto sono poste insieme su un terreno privo di azoto ridotto (terreno -N). La mancanza di azoto induce un segnale che avvia il programma di accoppiamento e porta alla sporulazione per produrre spore aploidi. Tuttavia, se non è presente un partner per l’accoppiamento, le cellule entrano lentamente in uno stato G0 caratterizzato dalla forma a bastoncello di S. pombe, diventando piccole cellule rotonde. Queste cellule possono sopravvivere per mesi e rientrare nel ciclo cellulare quando l’azoto viene aggiunto nuovamente al mezzo e sono quindi cellule Q per questa specie (Su et al., 1996; Yanagida, 2009). È importante notare che queste cellule Q non sono osservate nelle colture che smettono di crescere per aver esaurito le loro scorte di glucosio (riviste in Yanagida, 2009). Poiché l’esaurimento del glucosio è ciò che causa l’arresto durante la CLS di S. pombe (Fig. 30.2E), è improbabile che le piccole cellule Q rotonde svolgano un ruolo importante in questi saggi.
Una notevole quantità di analisi e caratterizzazione del trascrittoma è stata fatta per determinare quali geni sono necessari per produrre le cellule Q di S. pombe. Il risultato è stato l’identificazione di geni per proteine che agiscono in quasi tutti i compartimenti cellulari (Yanagida, 2009; Shimanuki et al., 2007). Una grande sfida è quella di determinare come questi molti attori sono coordinati per governare l’istituzione, il mantenimento e lo smontaggio dello stato delle cellule Q, in effetti l’opposto della situazione in S. cerevisiae, dove parti del macchinario centrale sono note. Il lavoro futuro determinerà quanto bene le informazioni di questi due lieviti possono aiutare a colmare le nostre lacune nella comprensione dello stato Q-cellulare e se esistono differenze fondamentali come si vede nell’invecchiamento replicativo.