9.5 Rol van Nanobiosensoren in de diagnostiek van TB
De tuberkelbacterie is traag in groei en doet er 1-2 maanden over om in vitro te groeien (Tortoli et al., 1997; Davies et al., 1999). Daarom is het moeilijk om de aanwezigheid van een infectie in een vroeg stadium vast te stellen. Ziehl-Neelsen kleuring is de conventionele methode voor de identificatie ervan. Deze kleuring is nodig voor de voorlopige identificatie van het oorzakelijke organisme, maar is niet erg gevoelig (Moore and Curry, 1998; Mahaisavariya et al., 2005). De conventionele methoden voor het kweken van mycobacteriën zijn tijdrovend en vergen verscheidene weken. Polymerase kettingreactie (PCR) is een gevoelige methode voor de vroegtijdige opsporing van mycobacteriën, maar het amplificatieproces vergt veel verwerkingstijd, chemicaliën en reagentia, wat bijdraagt tot de hoge kosten van de test. Bovendien is het een arbeidsintensieve en dure methode (Tombelli et al., 2000; Minnuni et al., 2005). Daarom is er dringend behoefte aan de ontwikkeling van een snelle, goedkope en gemakkelijke diagnostische methode voor de opsporing van TB. In dit opzicht lijken biosensoren een goede optie te zijn. Er is een toenemende vraag naar biosensortechnologie voor een snelle en nauwkeurige detectie van TB met een hoge affiniteit en specificiteit. Biosensortechnologie biedt de mogelijkheid van een kwalitatieve en kwantitatieve analyse en is vrij van radioactieve of fluorescerende tags (Tombelli et al., 2000, Zhou et al., 2001; Yao et al., 2008).
De laatste jaren zijn, gezien de voordelen van diverse opmerkelijke studies die in de nanotechnologie zijn uitgevoerd, belangrijke inspanningen verricht om deze te combineren met zeer gevoelige en nauwkeurige biosensortechnologie om nanobiosensoren te ontwikkelen. Nanobiosensorsystemen worden efficiënt gebruikt bij de diagnose van ziekten, milieubewaking, controle van de voedselkwaliteit en defensie als een slimme aanpak (Zhou et al., 2011; Rai et al., 2012; Singh et al., 2014). Zo hebben Duman et al. (2009) met behulp van met goud beklede nanobiosensoren aangetoond dat doelmoleculen (synthetische en PCR-producten) zeer effectief op nanomolaire niveaus kunnen worden gedetecteerd. Een enkelstrengs oligodeoxynucleotide met een thiolgroep aan het eind en complementair aan de karakteristieke doelsequentie van het MTB-complex werd gebruikt als de probe, geïmmobiliseerd op het met goud beklede oppervlak van de oppervlakteplasmonresonantie-glaasjes. Het is interessant op te merken dat het sensorplatform herbruikbaar is en een lange houdbaarheid heeft. Een kwartskristal microbalans (QCM) biosensor in combinatie met AuNPs is ontwikkeld voor de detectie van MTB (Kaewphinit et al., 2012). Volgens de studie verbeterden AuNPs de gevoeligheid van geïmmobiliseerde gouden elektrode van kwartskristal met behulp van de specifieke thiol-gemodificeerde oligonucleotide probe. De QCM bleek tot 5 pg MTB genomisch DNA te kunnen detecteren zonder enige cross-hybridisatie met andere mycobacteriën.
In de afgelopen jaren hebben veel technieken de materialen op nanoschaalniveau geëxploiteerd voor het ontwerpen van biosensoren met een hoge specificiteit en werkzaamheid. Van alle nanomaterialen zijn metaaloxiden van bijzonder belang vanwege hun unieke fysische, chemische en katalytische eigenschappen (Shi et al., 2014). Das et al. (2010) hebben een belangrijke poging gedaan om de toepassing van dergelijke metaaloxiden te diversifiëren in de generatie van nanobiosensoren voor de detectie van mycobacteriën. Zij deponeerden zinkoxide op nanoschaal op de met indium-tinoxide (ITO) gecoate glasplaat. De aanwezigheid van nanogestructureerde ZnO-films maakte een vergroting mogelijk van het elektro-actieve oppervlak voor het laden van DNA-moleculen en voor het detecteren van genomisch doel-DNA tot 100 pM, wat de directe detectie mogelijk maakt van ziekteverwekkers in klinische monsters op de plaats van verzorging. De voornaamste kenmerken van de techniek zijn: (i) de covalente immobilisatie van de sensor zonder gebruik te maken van een cross-linker die de gevoeligheid zou kunnen beperken; (ii) detectiegrens van 0,065 ng/µL; (iii) het detectieproces vergt slechts 60 s; (iv) kan tot 10 keer hergebruikt worden; en (v) stabiel tot 4 maanden bij 4°C. Daarom is het een efficiënte nanobiosensor voor een snelle en nauwkeurige diagnose van mycobacteriën (Das et al., 2010). Zirkoniumoxide (ZrO2) is een belangrijk metaaloxide met een grotere stabiliteit en inertheid. Bovendien heeft het affiniteit met zuurstofhoudende groepen. Das et al. (2011) ontwikkelden nanocomposiet-gebaseerde nucleïnezuur nanobiosensoren van zirkoniumoxide en koolstofnanobuisjes (NanoZrO2-CNT) afgezet op ITO. De groep gebruikt deze elektrode (NanoZrO2-CNT/ITO) voor immobilisatie van enkelstrengs probe DNA (ssDNA) specifiek voor MTB om de toepassing ervan op biosensor voor nucleïnezuur detectie te onthullen.
Thiruppathiraja et al. (2011) vervaardigd en geëvalueerd de DNA-elektrochemische biosensor voor genomisch DNA van Mycobacterium sp. met behulp van een signaalversterker als dubbel-gelabelde gouden nanodeeltjes (AuNPs). De methode omvat de sandwich-detectiestrategie met twee typen DNA-probes: de probes van het enzym ALP en de detector probe geconjugeerd op AuNPs. Beide probes waren specifiek voor Mycobacterium sp. genomisch DNA. In de studie werd gesteld dat onder geoptimaliseerde omstandigheden de detectiegrens van de methode 1,25 ng/mL genomisch DNA bedroeg. De genoemde nanobiosensoren waren ook veelbelovend en evaluatie van de klinische sputummonsters toonde de hogere gevoeligheid en specificiteit aan. Een andere studie (Torres-Chavolla en Alocilja, 2011) met verschillende benaderingen fabriceerde ook de DNA-gebaseerde biosensor die AuNPs en amine-getermineerde magnetische deeltjes (MPs) omvatte om de mycobacteriën te detecteren. De studie maakte gebruik van thermofiele helicase-afhankelijke isothermische amplificatie (tHDA) en dextrine-gecoate AuNPs als elektrochemische reporters. De AuNPs en MPs werden onafhankelijk van elkaar gefunctionaliseerd met verschillende DNA-probes die specifiek hybridiseerden met een fragment binnen een gen van mycobacteriën. Later scheidde deze groep het MP-doel-AuNPs complex magnetisch van de oplossing en detecteerde de AuNPs elektrochemisch. Torres-Chavolla en Alocilja (2011) beweerden dat de gevoeligheid van deze methode 0,01 ng/μL was van een isotherm geamplificeerd doelwit van 105 bp. Een dergelijke sensor kan dus worden gebruikt om regelmatig klinische monsters te analyseren waarvan vermoed wordt dat ze mycobacteriën bevatten.
Naast metaaloxidenanodeeltjes krijgt poreus silicium ook meer aandacht voor biosensortoepassingen, meestal in labelvrije toepassingen. Wu et al. (2012) maakten gebruik van een nanoschaal poreuze silicium micro-cavity biosensor voor snelle serodiagnose van MTB. Door middel van een reeks experimenten getuigde de studie van de haalbaarheid van deze biosensor voor de detectie van de interactie tussen 16 kDa antigeen en 16 kDa antilichaam. De opsporing van MDR-TB is van het grootste belang. In een recente studie rapporteerden Li et al. (2014) de ontwikkeling van een DNA-sensor voor de specifieke detectie van het rpoB-gen van MDR-TB door gebruik te maken van ruthenium (II) complex-gefunctionaliseerd grapheme-oxide (Ru-GO) als een suspensie-sensing interface en ferroceen-gelabeld enkelstrengs DNA (FC-ssDNA) als een electrochemiluminescentie (ECL) intensiteitsregelaar. De test berust op het principe dat wanneer het gemuteerde ssDNA-doelwit hybridiseert met FC-ssDNA, het vrijkomt van het Ru-Go oppervlak, wat leidt tot herstel van ECL. De assay heeft naar verluidt een detectiebereik van 0,1 tot 100 nM en een gevoeligheid van 0,04 nM.
Meer studies zijn nodig die zich vooral richten op de fabricage van verschillende nanobiosensoren voor de diagnose van zo’n vreselijke ziekte. Omdat deze techniek zeer gevoelig is, weinig monstervoorbereiding vergt en snel, specifiek, goedkoop en gemakkelijk te gebruiken is, heeft zij een groot potentieel voor de klinische diagnose van TB.