Cabrillo jako młody człowiek popłynął do Hawany i połączył siły z Hernánem Cortésem w Meksyku (wówczas zwanym Nową Hiszpanią). Później, jego sukces w wydobyciu złota w Gwatemali uczynił go jednym z najbogatszych konkwistadorów w Meksyku. Według jego biografa Harry’ego Kelseya, pojął za żonę tubylczynię i spłodził z nią kilkoro dzieci, w tym co najmniej trzy córki. Później poślubił Beatriz Sanchez de Ortega w Sewilli podczas przerwy w podróży do Hiszpanii. Ona wróciła z nim do Gwatemali i urodziła mu dwóch synów.
Cabrillo korzystał z systemu encomienda, który zniewalał rdzennych mieszkańców obu Ameryk. W Hondurasie, na przykład, rozbił rodziny, wysyłając mężczyzn do kopalni po złoto i do lasu, by zbierali materiały potrzebne do budowy statków. Kobiety i dziewczęta oddał swoim żołnierzom i marynarzom, przypuszczalnie jako niewolnice.
Towarzyszył Francisco de Orozco, który podporządkował sobie rdzennych Mixteców w miejscu, które ostatecznie stało się miastem Oaxaca w Meksyku. Niewiele wiadomo o tym, co Cabrillo tam robił.
W 1539 roku Francisco de Ulloa, który otrzymał zlecenie od Cortésa, odkrył Zatokę Kalifornijską i dotarł prawie tak daleko na północ, jak 30. równoleżnik. Cabrillo otrzymał wtedy zlecenie od nowego wicekróla Nowej Hiszpanii, Antonio de Mendozy, by poprowadzić ekspedycję w górę wybrzeża Pacyfiku w poszukiwaniu możliwości handlowych, być może w celu znalezienia drogi do Chin (nie znano bowiem pełnego zasięgu północnego Pacyfiku) lub odnalezienia mitycznej Cieśniny Anián (lub Przejścia Północno-Zachodniego) łączącej Ocean Spokojny z Zatoką Hudsona. Cabrillo zbudował i posiadał flagowy okręt swojego przedsięwzięcia (dwa lub trzy statki), a także czerpał zyski z handlu i skarbów.
W 1540 roku flota wypłynęła z Acajutla w Salwadorze i dotarła do Navidad w Meksyku w Boże Narodzenie. Będąc w Meksyku, Pedro de Alvarado udał się na pomoc miastu Nochistlán, które było oblężone przez wrogich tubylców, i został zabity, gdy jego koń spadł na niego, miażdżąc jego klatkę piersiową. Po śmierci Alvarado, wicekról wziął w posiadanie flotę Alvarado. Część floty została wysłana na Wyspy Filipińskie pod dowództwem Ruy López de Villalobos, a dwa statki zostały wysłane na północ pod dowództwem Cabrillo.
27 czerwca 1542 roku Cabrillo wyruszył z Navidad z trzema statkami: 200-tonowym galeonem i okrętem flagowym San Salvador, mniejszą La Victoria (ok. 100 ton) i dwudziestosześcioosiową „fragata” lub „bergantin” San Miguel. 1 sierpnia Cabrillo zakotwiczył w zasięgu wzroku przy wyspie Cedros. Przed końcem miesiąca minęli Baja Point (nazwany „Cabo del Engaño” przez de Ulloa w 1539 roku) i wpłynęli na „niezbadane wody, gdzie nie było wcześniej hiszpańskich statków”. 28 września wylądował w dzisiejszej zatoce San Diego i nazwał ją „San Miguel”. Nieco ponad tydzień później dotarł do wyspy Santa Catalina (7 października), którą nazwał „San Salvador”, po swoim okręcie flagowym. Po wysłaniu łodzi na wyspę „pojawił się wielki tłum uzbrojonych Indian” – z którymi jednak później „zaprzyjaźnili się”. Pobliska wyspa San Clemente została nazwana „Victoria”, na cześć trzeciego statku floty. Następnego ranka, 8 października, Cabrillo przybył do Zatoki San Pedro, która została nazwana „Baya de los Fumos” (Zatoka Dymu). Następnego dnia zakotwiczył na noc w zatoce Santa Monica. Idąc w górę wybrzeża Cabrillo zobaczył wyspę Anacapa, o której dowiedział się od Indian, że jest niezamieszkana.
Kolejny tydzień flota spędziła na wyspach, głównie zakotwiczona w Cuyler Harbor, zatoce na północno-wschodnim wybrzeżu wyspy San Miguel. W październiku 1542 roku ekspedycja Cabrillo zanotowała nazwy licznych wiosek Chumash na wybrzeżu Kalifornii i przyległych wyspach – znajdujących się wówczas w dwóch walczących ze sobą prowincjach Xexo (rządzonej przez „starą kobietę”, obecnie hrabstwo Santa Barbara w Kalifornii) i Xucu (obecnie hrabstwo Ventura w Kalifornii).
13 listopada zauważyli i nazwali „Cabo de Piños” (prawdopodobnie Point Pinos lub Point Reyes), ale przegapili wejście do Zatoki San Francisco, co marynarze powtarzali przez następne dwa stulecia i dłużej, najprawdopodobniej dlatego, że wejście do niej często spowija mgła. Ekspedycja mogła dotrzeć aż do rzeki Russian River lub nawet Columbia, zanim jesienne sztormy zmusiły ją do zawrócenia. Z powodu niejasności jego opisu nie jest pewne, którą północną rzekę wyprawa zobaczyła. Wracając w dół wybrzeża Cabrillo wpłynął do zatoki Monterey, nadając jej nazwę „Bahia de Los Piños”.
23 listopada 1542 roku mała flota przybyła z powrotem do „San Salvador” (wyspa Santa Catalina), aby przezimować i dokonać napraw. Tam, około Wigilii, Cabrillo wyszedł z łodzi i roztrzaskał sobie goleń, gdy potknął się o poszarpaną skałę, próbując uratować swoich ludzi przed atakiem wojowników Tongva. Rana uległa zakażeniu i rozwinęła gangrenę, a on sam zmarł 3 stycznia 1543 roku i został pochowany. Prawdopodobny nagrobek został później odnaleziony na wyspie San Miguel. Jego zastępca sprowadził resztę załogi z powrotem do Navidad, gdzie przybyli 14 kwietnia 1543 r.
Oficjalny raport notariusza z wyprawy Cabrillo zaginął; wszystko, co przetrwało, to streszczenie sporządzone przez innego badacza, Andrésa de Urdanetę, który miał również dostęp do dzienników okrętowych i map. Żadna drukowana relacja z podróży Cabrillo nie pojawiła się przed relacją historyka Antonio de Herrery na początku XVII wieku.