High-Throughput Advances for Chronological Life Span and New Attention for Quiescent Cells
CLS w S. cerevisiae i S. pombe używa podobnych testów do określenia jak długo komórki mogą przetrwać w płynnej kulturze po wyczerpaniu glukozy i różnych innych składników odżywczych (Longo et al., 2012; Chen i Runge, 2009, 2012; Fabrizio i Longo, 2003; Zuin i in., 2008, 2010). Ponieważ komórki zatrzymują się w wyniku głodzenia, wykrywanie składników odżywczych i degradacja wewnętrznych składników białkowych przez autofagię odgrywają ważną rolę w CLS (Sideri i in., 2014; Yamaguchi i Otsu, 2012; Alvers i in., 2009a,b; Aris i in., 2012, 2013). Projektowanie testów CLS wymaga, aby pamiętać o kilku kluczowych kwestiach. Po pierwsze, jeśli próba CLS ma być modelem dla innych organizmów, to powinna ona mieć takie same efekty na drożdżach, jak analogiczna próba na innych modelach. Dla większości organizmów, te cechy obejmują przedłużenie życia przez ograniczenie kalorii, a te długo żyjące komórki są często odporne na stres (np., Fabrizio et al., 2001). Chociaż warunki te zostały ustalone dla S. cerevisiae dawno temu, podstawowa pożywka syntetyczna używana w badaniach nad S. pombe, zwana Edinburgh Minimal Medium (EMM lub EMM2), nie odtwarza tych konserwatywnych cech długości życia i restrykcji kalorycznej (Chen i Runge, 2009). Zamiast tego S. pombe wymaga albo bogatej pożywki YES (ekstrakt drożdżowy (YE) i suplementy (S) oraz źródło węgla) albo pożywki zwanej SD (syntetyczna pożywka chemiczna (S) plus dekstroza (D)) z innymi poziomami składników niż EMM (Chen i Runge, 2009; Zuin et al., 2010). Po drugie, badanie powinno uwzględniać informacje o organizmie modelowym. S. cerevisiae i S. pombe mogą szybko wyhodować całe populacje z pojedynczej komórki, czego nie można zrobić z ludźmi lub myszami. Drożdże mogą więc inaczej regulować swoje podstawowe mechanizmy, gdy większość komórek w hodowli obumiera (np. gdy liczba komórek spada z ∼108 do 10 komórek/mL), niż gdy liczba komórek spada do 1% pierwotnego poziomu (z ∼108 do 106 komórek/mL). W rzeczywistości, S. cerevisiae zachowują się w sposób złożony w teście CLS, ponieważ gdy liczba komórek spadnie do ∼0,1% pierwotnej gęstości żywych komórek na ml w teście CLS, część komórek zacznie się odrastać (Fabrizio i in., 2004) (Rys. 30.2B). Komórki również zatruwają się, wydzielając do pożywki małe kwasy organiczne (np. kwas octowy) (Burtner i in., 2009). To złożone zachowanie powoduje, że większość testów CLS S. cerevisiae nie wykracza poza utratę żywotności poniżej 1%. W przeciwieństwie do tego, test CLS S. pombe może wykazać spadek żywotności o 5-6 rzędów wielkości bez odrastania, co pozwala na łatwiejsze wyizolowanie długo żyjących komórek (Chen i Runge, 2009; Chen i in., 2013).
Obaj gatunki S. cerevisiae i S. pombe zostały użyte do badania ich odpowiednich genomowych zestawów szczepów delecyjnych w poszukiwaniu mutantów z przedłużonym CLS. Każda delecja genu jest oznaczona przez unikalną sekwencję DNA lub kod kreskowy. Te badania CLS obejmowały przeżywalność w płytkach mikrotitracyjnych (Powers i in., 2006) lub standardowe badanie z wykorzystaniem kodów kreskowych związanych z delecjami w celu identyfikacji mutantów związanych z różnymi okresami życia. Częstotliwości kodów kreskowych zostały określone przy użyciu hybrydyzacji mikromacierzy (Wei i in., 2008) lub podejścia sekwencjonowania kodów kreskowych (Chen i in., 2013; Sideri i in., 2014). Zidentyfikowano również dodatkowe geny, które wydłużają CLS przy nadekspresji (Ohtsuka i in., 2009; Miwa i in., 2011). Podczas gdy lista genów regulujących długość życia nie będzie tutaj przeglądana, ważne jest, aby zauważyć, że TOR okazał się ważnym regulatorem długości życia u obu drożdży (Powers i in., 2006; Wei i in., 2008; Sideri i in., 2014). Ogólnie rzecz biorąc, standardowe testy CLS przyniosły wiele informacji, które podkreślają znaczenie zestawu ewolucyjnie konserwowanych szlaków, które kontrolują starzenie się (Longo i in., 2012).
Wyniki testów CLS przedstawiają pewne zagadki. Dlaczego S. cerevisiae są tak zmienne pod koniec CLS? Dlaczego S. pombe mają tak krótki CLS (14 dni)? Chociaż odpowiedzi na te pytania nie są znane, jedną z możliwości jest to, że testy nie uwzględniają niedocenianych cech ewolucyjnych u obu gatunków. Jedną z takich cech, która zwykle nie jest brana pod uwagę, jest inny zróżnicowany stan drożdży, który występuje w testach CLS, quiescent G0 cell lub Q cell.
Gdy S. cerevisiae rośnie do nasycenia i pozostaje w hodowli, część komórek różnicuje się w małe, gęste komórki, które mogą być izolowane z dala od reszty populacji (Allen et al., 2006) (Rys. 30.2D). Nowsze badania wykazały, że komórki Q mogą być odseparowane od pozostałych komórek za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją w celu analizy (Miles i Breeden, 2017). Komórki te mają niezwykłe właściwości w zakresie CLS. Mogą przetrwać prawie 1 rok w wodzie, są wysoce odporne na stres i synchronicznie wchodzą ponownie w cykl komórkowy, gdy dodawane są do nich składniki odżywcze (Allen i in., 2006; Miles i Breeden, 2017). Fakt, że tworzą się one kilka dni po rozpoczęciu CLS wskazuje, że prawdopodobnie odgrywają rolę w analizie komórek CLS. To, czy doceniana obecnie obecność komórek Q w analizach S. cerevisiae CLS wnosi jakąkolwiek różnicę do wcześniejszych wniosków wyciąganych na ich podstawie, jest obecnie niejasne. Laboratorium Breedena w ostatnich latach intensywnie analizowało komórki Q S. cerevisiae, a wykazano, że represory transkrypcyjne i remodelery chromatyny (np. Xbp1 i Rpd3) odgrywają kluczowe role w tym procesie (Miles i Breeden, 2017; Miles i wsp., 2013; McKnight i wsp., 2015). Białka znane z roli w przejściu G1/S cyklu komórkowego pełnią również role w przejściu do quiescence (np. kompleks transkrypcyjny SBF), a te podstawowe kompleksy są przystosowane do indukcji quiescence poprzez przejęcie innych czynników (np. Msa1 i Msa2) (Miles i in., 2016). Tak więc, poprzez wykorzystanie informacji z komórek cyklicznych, kluczowa maszyneria komórkowa, która reguluje wejście do G0 jest wyjaśniana. Ponieważ identyfikacja takich podstawowych mechanizmów jest głównym celem badań nad starzeniem się, praca ta stanowi ważny krok naprzód. Ważnym zadaniem w przyszłości będzie określenie, jakie inne procesy komórkowe są kontrolowane przez te konserwatywne szlaki.
Quiescence u S. pombe przebiega nieco inaczej. Kiedy S. pombe jest kojarzony w laboratorium, dwie komórki o przeciwnych typach kojarzenia są umieszczane razem na pożywce pozbawionej zredukowanego azotu (pożywka -N). Brak azotu wywołuje sygnał, który uruchamia program kojarzenia i prowadzi do sporulacji w celu wytworzenia haploidalnych zarodników. Jeśli jednak partner do kojarzenia nie jest obecny, komórki powoli wchodzą w stan G0, charakteryzujący się pręcikowatym kształtem S. pombe, stając się małymi, okrągłymi komórkami. Komórki te mogą przetrwać miesiące i ponownie wejść w cykl komórkowy po dodaniu azotu do pożywki, są więc komórkami Q dla tego gatunku (Su i in., 1996; Yanagida, 2009). Co ważne, komórki Q nie są obserwowane w hodowlach, które przestają rosnąć z powodu wyczerpania zapasów glukozy (przegląd w Yanagida, 2009). Ponieważ wyczerpanie glukozy jest tym, co powoduje zatrzymanie wzrostu podczas S. pombe CLS (Rys. 30.2E), małe okrągłe komórki Q wydają się nie odgrywać głównej roli w tych badaniach.
Wielka ilość analiz transkryptomu i charakteryzacji została przeprowadzona w celu określenia, jakie geny są wymagane do wytworzenia komórek Q S. pombe. W rezultacie zidentyfikowano geny dla białek, które działają w prawie każdym przedziale komórkowym (Yanagida, 2009; Shimanuki i in., 2007). Głównym wyzwaniem jest ustalenie, w jaki sposób te liczne podmioty są skoordynowane w celu regulowania ustanowienia, utrzymania i rozpadu stanu komórek Q, w efekcie odwrotnie niż w S. cerevisiae, gdzie części podstawowej maszynerii są znane. Przyszłe prace określą, jak dobrze informacje z tych dwóch drożdży mogą pomóc wypełnić nasze luki w zrozumieniu stanu komórek Q i czy istnieją fundamentalne różnice, jak to widać w starzeniu replikacyjnym.