Staging of the estrous cycle and induction of estrus in experimental rodents: an update

Znaczenie zwierząt doświadczalnych w nauczaniu i badaniach jest nie do przecenienia. Badania z wykorzystaniem modeli zwierzęcych mają takie zalety, jak dostępność obiektów doświadczalnych, możliwość wykonywania badań inwazyjnych, obszerne pobieranie próbek tkanek oraz standaryzacja nasilenia choroby i możliwość profilaktyki. Inne zalety obejmują bezpieczne postępowanie z uczestnikami, eliminację odchodzenia z badania (z wyjątkiem przypadków śmiertelnych) oraz kontrolowane warunki eksperymentalne. Chociaż wybór zwierzęcia w badaniach biomedycznych dla konkretnego dochodzenia może być kontrowersyjny i wysoce opiniotwórczy, do powszechnie stosowanych zwierząt doświadczalnych należą myszy, szczury i króliki. Małe gryzonie, takie jak myszy i szczury są bardziej preferowane niż większe zwierzęta, takie jak króliki, psy, koty, świnie i małpy .

W badaniach funkcji rozrodczych, szczególnie tych obejmujących wykorzystanie zwierząt płci żeńskiej, myszy i szczury są powszechnie stosowane, prawdopodobnie ze względu na ich dobrze scharakteryzowany cykl rujowy i bezpieczną obsługę. Krótka i precyzyjna długość okresu rui u tych gryzoni również czyni je bardzo odpowiednimi. Określenie fazy rujowej jest niezbędne do wyboru samicy, która będzie łączyć się w pary z samcem w celu osiągnięcia ciąży w określonym czasie lub śledzenia fazy rujowej jako zmiennej, która może mieć wpływ na badania. Ocena cyklu rujowego u zwierząt doświadczalnych jest użyteczną miarą integralności osi podwzgórze-przysadka-jajnik oraz funkcjonującego statusu reprodukcyjnego żeńskiego układu rozrodczego. Może być również wykorzystywany do badania wpływu leków i substancji chemicznych na funkcje rozrodcze, często wyrażonego jako zaburzenia typowej morfologii, cytologii i histologii narządów rozrodczych oraz zmiany w czasie trwania poszczególnych faz cyklu rujowego.

Cykl rujowy

Cykl rujowy odnosi się do cyklu rozrodczego u gryzoni. Jest on podobny do cyklu rozrodczego człowieka, zwanego potocznie cyklem menstruacyjnym (cykl jajnikowy i cykl maciczny). Cykl rujowy składa się z czterech faz: proestrus, estrus, metestrus i diestrus i trwa od 4 do 5 dni (Tabela 1). Okres rozrodczy i cykl rujowy u myszy rozpoczyna się około 26. dnia po urodzeniu wraz z otwarciem pochwy, co stanowi około 10 dni przed rogowaceniem pochwy. Wywołane apoptozą otwarcie pochwy jest istotną cechą wtórną u myszy, która jest wykorzystywana jako predyktor dojrzewania płciowego. Rozwijanie się pochwy związane jest ze wzrostem stężenia estradiolu. U szczurów otwarcie pochwy następuje podczas pierwszej owulacji.

W samicach szczurów dojrzewanie płciowe poprzedzone jest pulsacyjnym uwalnianiem hormonu luteinizującego (LH) po 4 tygodniu postnatalnym, w wieku około 30 dni . Okres ten jest anestrus i występuje około 8 do 9 dni przed pierwszym proestrus . Pierwszy proestrus, estrus, metestrus i diestrus następnie śledzić. Metestrus występuje tylko w przypadku braku poczęcia .

Z drugiej strony, u ludzi, istnieją trzy fazy cyklu miesiączkowego; menstruacyjne, proliferacyjne (pęcherzykowe) i wydzielnicze (lutealne) fazy. Cykl ten rozpoczyna się w okresie dojrzewania. Przeciętnie trwa on około 28 dni od początku jednej miesiączki do początku następnej. W połowie cyklu, pomiędzy fazą proliferacyjną a fazą wydzielniczą, znajduje się faza owulacyjna, podczas której dochodzi do jajeczkowania w następstwie przypływu LH. Faza proliferacyjna związana jest przede wszystkim z wysokim poziomem estrogenów, podczas gdy faza wydzielnicza związana jest z wysokim poziomem progesteronu .

Faza proestrus odpowiada ludzkiemu stadium pęcherzykowemu, które związane jest ze wzrostem stężenia krążącego estradiolu i niewielkim skokiem prolaktyny, co prowadzi do wzrostu uwalniania LH i hormonu stymulującego pęcherzyki (FSH). Szczyt stężenia FSH z towarzyszącym mu gwałtownym spadkiem poziomu estradiolu, koreluje z owulacją i fazą estrus. Metestrus i diestrus są homologiczne do ludzkich wczesnych i późnych faz wydzielniczych cyklu rozrodczego, odpowiednio, z wysokim poziomem progesteronu .

Perspektywa historyczna

Słowo „estrus” zostało po raz pierwszy użyte przez Heape . Jest to łacińska adaptacja greckiego słowa „oistros”, które oznacza „sezon seksualny”, „gaduła”, „szał”, „żądło” lub „szaleństwo”. Heape dalej nazwał i zdefiniował fazy cyklu rujowego u ssaków na proestrus, metestrus, diestrus i anestrus. Proestrus jest etapem przygotowawczym dla zwierzęcia wchodzącego w rui, metestrus, który jest krótki okres charakteryzujący się spadkiem funkcji corpus luteum w przypadku braku poczęcia, kiedy działalność narządów rozrodczych stopniowo ustępuje, diestrus, który jest okresem krótkiego odpoczynku w sezonie rozrodczym, i anestrus, który jest okresem bez rozrodu, kiedy narządy rozrodcze są quiescent . Zmiany behawioralne, jak również morfologiczne, cytologiczne i histologiczne zmiany w drogach rodnych opisują te fazy.

W początkowym okresie, makroskopowe zmiany w sromie (takie jak obrzęk sromu), wydzieliny pochwy (takie jak krwawienie i śluz) i macicy (takie jak przekrwienie), jak również mikroskopowe zmiany w drogach rodnych były używane do określenia faz cyklu rujowego. Jednakże, wyniki makroskopowe były niewiarygodne u małych gryzoni, a analiza histologiczna była i jest procedurą inwazyjną, która nie nadaje się do oceny cyklu rujowego u żywych zwierząt. Stockard i Papanicolaou scharakteryzowali później zmiany zachodzące w pochwie podczas cyklu rujowego za pomocą histologii i cytologii, co pozwoliło na ominięcie wcześniejszych problemów związanych z nierzetelnością i inwazyjnością. Z czasem różne badania potwierdziły ocenę Stockarda i Papanicolaou; doprowadziło to do powstania istniejących definicji faz cyklu estralnego. Wymaz Pap Papanicolaou jest do dziś stosowany jako badanie przesiewowe w kierunku raka szyjki macicy.

Techniki oceny cyklu rujowego

Wiele badań zaproponowało różne metody oceny cyklu rujowego w oparciu o zmiany w fizjologii i anatomii zwierzęcia. Metody te obejmują ocenę wizualną, cytologię pochwy, badanie histologiczne narządów rozrodczych, impedancję ściany pochwy i biochemię moczu.

Ocena wizualna

Obowizualna metoda oceny cyklu rujowego jest powszechnie akceptowana. Jest ona nieinwazyjna, prosta, tania, szybka, mniej stresująca dla zwierząt i badaczy, i może być przeprowadzona w dowolnym miejscu i czasie, pod warunkiem, że oświetlenie jest odpowiednie. Metoda ta jest równie dokładna i wiarygodna jak wymaz z pochwy. Została ona uznana za najszybszą metodę określania fazy estrus . Jednak większość badań, które zgłosiły tę metodę używane myszy; może to sugerować, że technika ta jest bardziej odpowiednia dla małych zwierząt, takich jak myszy i szczury. Wyniki uzyskane tą techniką są również zależne od obserwatora.

W wizualnej ocenie fazy estrus, mysz powinna być trzymana w niedominującej ręce i ułożona w urządzeniu przytrzymującym z przednimi łapami spoczywającymi na powierzchni, delikatnie podnieść ogon, a następnie zbadać i ocenić srom w oparciu o kryteria Champlin i wsp. Ważne jest również unikanie pośpiesznych badań, aby zapobiec błędnym interpretacjom.

Wygląd pochwy w różnych fazach cyklu rujowego podsumowano w tabeli 2. W fazie proestrus otwór pochwy wydaje się pełny, obrzęknięty i wilgotny. Tkanki są różowe, z prążkami zarówno na grzbietowej, jak i brzusznej wardze sromowej. W fazie estrus, pochwa wygląda podobnie jak w fazie proestrus, ale jest mniej różowa, mniej obrzęknięta i mniej wilgotna, z bardziej widocznymi prążkami. W metestrus otwór pochwy jest blady i suchy, z białą warstwą resztek komórkowych. Cechy diestrus obejmują bardzo wilgotny otwór pochwy, który czasami jest zbyt mały i zamknięty u niektórych myszy bez obrzęku tkanek (ryc. 1, 2 i 3).

Wymaz z pochwy/cytologia

Podobnie do oceny wizualnej, cytologia pochwy jest również szeroko akceptowana. Wydaje się być najczęstszą techniką wykorzystywaną do określania faz cyklu rujowego. Jest ona nieinwazyjna i stosunkowo niedroga. Chociaż metoda ta wymaga pewnej wprawy w mikroskopowym badaniu komórek wydzieliny pochwowej, jest dokładna i wiarygodna. Jednakże, metoda ta została również zgłoszona jako żmudne i czasochłonne .

Podczas oceny, zwierzę i jego przednie łapy są skrępowane. Ogon jest uniesiony w celu uwidocznienia pochwy. Komórki pochwy są przepłukiwane przez delikatne wprowadzenie niewielkiej ilości (100 μl) wody destylowanej lub soli fizjologicznej za pomocą pipety lub sterylnej lateksowej bańki. Alternatywnym płynem może być sól fizjologiczna buforowana fosforanami. Powoli uwolnić płyn do pochwy i wciągnąć go z powrotem do końcówki; czynność tę należy powtórzyć około 4 do 5 razy przy użyciu tej samej sterylnej lateksowej bańki. Należy upewnić się, że pipeta lub jałowa lateksowa bańka jest umieszczona przy wejściu do kanału pochwy i nie penetruje otworu pochwy. Płyn zawierający kilka kropli zawiesiny komórkowej jest następnie wprowadzany na szkiełko szklane, suszony na powietrzu i odpowiednio barwiony. Można użyć 0,1% barwnika fioletu krystalicznego (0,1 g proszku fioletu krystalicznego w 100 ml wody podwójnie destylowanej). Alternatywnymi barwnikami są barwniki typu Romanowskiego (takie jak zmodyfikowany barwnik Wrighta, Giemsa Wrighta) i błękit toluidyny O . Następnie szkiełko powinno zostać przykryte szkiełkiem nakrywkowym i natychmiast zbadane pod mikroskopem świetlnym przy powiększeniu 200 X.

Alternatywnie, wymaz z pochwy można uzyskać przy użyciu wacika zwilżonego solą fizjologiczną o temperaturze otoczenia i wprowadzonego do pochwy skrępowanej myszy. Wymaz powinien być delikatnie obracany i rolowany przy ścianie pochwy, a następnie usunięty. Zebrane komórki są następnie przenoszone na suche szkiełko szklane poprzez przesuwanie wacika po szkiełku. Szkiełko jest suszone powietrzem, barwione i oglądane pod mikroskopem .

Wydzielina pochwy składa się z trzech typów komórek. Należą do nich leukocyty, komórki nabłonka rogowaciejącego i komórki nabłonka jądrzastego. Oszacowanie fazy cyklu rujowego opiera się na proporcji tych komórek w wydzielinie pochwowej (Tabela 3 i Ryc. 4).

Numeryczne okrągłe komórki jądrzaste, które są jednolite pod względem wielkości i wyglądu, charakteryzują fazę proestrus. Występują one w skupiskach lub pojedynczo. Występują również nieliczne anucleated cornified epithelial cells. Niektóre białe krwinki mogą być obecne u samicy we wczesnej fazie proestrus (ryc. 5). W fazie estrus widoczne są obfite anukleowane komórki nabłonka rogowaciejącego. Cytoplazma jest ziarnista, a komórki mają nieregularny kształt. Obserwuje się również liczne bakterie oraz sporadycznie zarodkowane komórki nabłonkowe (ryc. 6 i 7). W okresie metestrus widoczna jest duża liczba leukocytów oraz niewielka liczba dużych, niegranulowanych i pozbawionych jąder komórek nabłonka rogowaciejącego. Tworzenie się ciałka żółtego, które nie ulega pełnej luteinizacji z powodu braku progesteronu i powoduje złuszczanie się wyściółki macicy, odpowiada za obecność zrogowaciałych komórek nabłonka i wielojądrzastych leukocytów w wymazach z pochwy. Niektóre jądrzaste komórki nabłonka mogą być również obecne w późnym okresie metestrus (ryc. 8 i 9). Diestrus wykazuje wyraźne leukocyty wielojądrowe oraz kilka komórek nabłonka i komórek zrogowaciałych. Leukocyty pozostają dominującym typem komórek po usunięciu resztek komórkowych (Ryc. 10).

Badanie histologiczne narządów rozrodczych

Chociaż określenie faz cyklu rujowego tą techniką jest bardzo wiarygodne i dokładne, ma wiele wad. Technika ta jest inwazyjna i nie jest przydatna do oceny estrogenów u żywych zwierząt laboratoryjnych. Jest ona również kosztowna i wymaga wysokich umiejętności. Jest również zbyt żmudna i czasochłonna. Metoda ta nie jest łatwo dostępna, stąd nie jest wykonalna, szczególnie w odległych obszarach regionu tropikalnego.

Minimalne wymagania dla oceny cyklu rujowego za pomocą histologii to kompletne przekroje podłużne pochwy i szyjki macicy, przekroje poprzeczne środkowej części obu rogów macicy oraz przekroje środkowe obu jajników. Obecność pęcherzyków jajnikowych nie może być wykorzystana do określenia fazy rujowej u szczurów i myszy o krótkich cyklach rujowych. Pęcherzyki są prawie zawsze obecne w jajnikach we wszystkich fazach. Jednakże, pojawienie się określonych morfologii ciałka żółtego może pomóc w określeniu fazy estrus, nawet jeśli nie jest ona ostateczna. Wycięte narządy są utrwalane w 10% formalinie, barwione hematoksyliną i eozyną, a następnie badane mikroskopowo.

Wygląd histologiczny narządów rozrodczych w różnych fazach estralnych przedstawiono w tabeli 4 i na rycinach 11, 12, 13 i 14.

Impedancja ściany pochwy

Mimo, że zastosowanie impedancji elektrycznej na ścianie pochwy do określenia fazy estrus jest kontrowersyjne i rzadko cytowane w literaturze, wydaje się, że zyskuje coraz większe zainteresowanie. Metoda ta jest wygodna, łatwo dostępna i wymaga mniejszych umiejętności. Jest ona znacznie mniej podatna na subiektywną interpretację ze strony operatora technicznego niż bardziej konwencjonalna metodologia rozmazu pochwowego. Jest jednak również kosztowna i nie jest powszechnie akceptowana, prawdopodobnie z powodu swojej zawodności. Technika ta pozwala raczej odróżnić zwierzęta estrus od nieestrus.

Monitor impedancji stosowany w tej technice składa się z miernika i sondy pochwowej (Ryc. 15). Jedna osoba krępuje zwierzę, podczas gdy druga wprowadza sondę dopochwową na około 30 s w celu dokonania pomiarów impedancji na ekranie miernika. Przed każdą analizą sonda jest czyszczona 70% alkoholem. Alternatywnie, można zastosować prosty, tani i przenośny miernik elektryczny zasilany bateriami, który mierzy opór w szerokim zakresie, powszechnie używany przez elektryków, jak opisano w Ramos i wsp. W przypadku stosowania tego alternatywnego urządzenia, należy do niego podłączyć przewody wykonane z wewnętrznego okablowania typowego niedrogiego ekranowanego kabla audio, a męski zacisk wykorzystać jako sondę pochwową (Rys. 16).