Strona główna Dokumenty Zadania Wiki Harmonogram Wiki Strony Sylabus kursu
Nowatorskie podejście do regeneracji tkanek
Jeden z najbardziej krytycznych momentów w dziedzinie inżynierii tkankowej miał miejsce w Bostonie w 1954 roku w projekcie kierowanym przez dr Josepha Murraya. Pod jego kontrolą zespół lekarzy przeprowadził z powodzeniem pierwszy przeszczep narządu stałego. W tym przypadku nerka została przeszczepiona od jednego z identycznych bliźniaków jego ciężko choremu bratu. Wydarzenie to pobudziło szeroki ruch badawczy, w ramach którego naukowcy i laboratoria rozpoczęły szeroko zakrojone prace w dziedzinie biologii transplantacyjnej, immunologii i innych pokrewnych dyscyplinach. Wraz z tymi badaniami nastąpił znaczny postęp w rozwoju technik chirurgicznych i w próbach poprawy tłumienia odporności gospodarza. Jednakże, nawet kilkadziesiąt lat później, wiele wyzwań nadal stoi na drodze do osiągnięcia sukcesu klinicznego w dziedzinie transplantacji tkanek. Niektóre z tych wyzwań obejmują wydatki związane z rzeczywistą procedurą przeszczepu, konieczną pracochłonną opiekę oraz wysokie prawdopodobieństwo odrzucenia przeszczepu przez gospodarza. Większość laboratoriów badawczych do lat 80-tych skupiała swoją uwagę na sposobach zwalczania „problemu immunologicznego” w celu poprawy technologii przeszczepiania narządów i rozwoju wykorzystania ksenograftów i biohybrydowych urządzeń wspomagających. Dopiero w połowie lat 80-tych, kiedy dr Joseph Vacanti ze Szpitala Dziecięcego w Bostonie połączył siły z dr Robertem Langerem z wydziału nauk o polimerach MIT, pomysł stworzenia funkcjonalnych tkanek do przeszczepów stał się potencjalnym rozwiązaniem problemu niedoboru narządów. Ich wspólna praca miała zredefiniować dziedzinę inżynierii tkankowej (1).
„Wizja”
Koncepcja
Vacanti i Langer przewidzieli rozwój systemu zdolnego do generowania nowych i naturalnych, trwałych substytutów tkanek przy użyciu trójwymiarowych syntetycznych, biodegradowalnych matryc nasyconych komórkami miąższowymi. Koncepcja ta zawierała wiele odpowiedzi na obecne problemy związane z zastępowaniem tkanek. W idealnym przypadku, polimerowe rusztowanie mogłoby być zaprojektowane tak, aby promować proliferację i różnicowanie komórek, umożliwiać wrastanie naczyń krwionośnych, ulegać kontrolowanej degradacji i całkowicie resorbować in vivo, pozostawiając jedynie nowo powstałą tkankę. Jeśli to się powiedzie, rozwój i wdrożenie tego urządzenia może zapewnić kilka korzyści w porównaniu z tradycyjnymi metodami, ponieważ rusztowanie może być potencjalnie manipulowane, aby umożliwić zwiększoną kontrolę nad uwalnianiem hormonów i czynników wzrostu istotnych dla funkcjonalności komórek, przywiązanie komórek do matrycy przed wprowadzeniem do ciała może zwiększyć liczbę komórek zdolnych do wszczepienia, forma może być uformowana w różne kształty, a ta metoda może pozwolić na autologiczne lub allogeniczne przeszczepy (1).
Dane wstępne i dowody potwierdzające
W trakcie swoich badań bracia Vacanti i Langer oparli swoją pracę na kilku podstawowych obserwacjach, które zostały zebrane w badaniach wstępnych. Po pierwsze, wszystkie organizmy nieustannie doświadczają procesów odnowy, przebudowy i wymiany swoich komórek. Po drugie, komórki, które są odłączone od swojego naturalnego środowiska, są w stanie zreformować swoje struktury, gdy są do tego odpowiednio sygnalizowane przez otaczające je środowisko. Po trzecie, komórki miąższowe narządów są zależne od zakotwiczenia w macierzy komórkowej i odgrywają zasadniczą rolę w kształtowaniu, podziale i różnicowaniu komórek. Ponadto, poprzednie badania wykazały, że 2-3mm3 to największa objętość tkanki, jaką można wszczepić, która umożliwia odpowiednie odżywianie, wymianę gazową, itp. do czasu wystąpienia angiogenezy. Mając na uwadze te biologiczne obserwacje, bracia Vacanti i Langer postanowili zaprojektować nowe polimerowe rusztowanie 3D, które mogłoby być wypełnione komórkami narządów paranchymalnych w hodowli, a następnie wszczepione gospodarzowi (1).
Idealna matryca
Jedną z kluczowych kwestii w projekcie rusztowania polimerowego do inżynierii tkanek zastępczych jest wybór odpowiedniego materiału matrycy. Ten idealny materiał rusztowania musiałby mieć kilka istotnych cech i możliwości dostrojenia dla właściwej funkcjonalności w tym zastosowaniu, ponieważ musi być–biokompatybilny, mechanicznie stabilny, elastyczny, kontrolowanie degradowalny, resorbowalny i zdolny do podejmowania specyficznych interakcji chemicznych z zasianymi komórkami. Pod względem biokompatybilności, istotne jest, aby polimer unikał wywoływania niepożądanej odpowiedzi immunologicznej u gospodarza, co ostatecznie mogłoby spowodować odrzucenie immunologiczne i niepowodzenie procedury. Fizycznie, matryca musi mieć pewien stopień stabilności mechanicznej i elastyczności, aby zapewnić niezbędne wsparcie i przestrzeń dla formowania tkanki, aby można ją było łatwo zaprojektować i skonstruować w różnych kształtach i strukturach, a także musi być w stanie wytrzymać procedurę i środowisko in vivo, aby utrzymać tę strukturę po wszczepieniu. Wreszcie, niektóre pożądane możliwości dostrojenia idealnego rusztowania polimerowego obejmowałyby przestrajalną charakterystykę degradacji, matryca powinna być zdolna do resorpcji do organizmu, pozostawiając jedynie naturalną, funkcjonalną tkankę, oraz manipulację chemią powierzchni w celu dyktowania pożądanych interakcji pomiędzy zasianymi komórkami a powierzchnią matrycy (1).
Bracia Vacanti i Langer ustalili, że polimery z grupy poliestrów oraz rodziny kwasów polimlekowych, poliglikolowych i ich kopolimerów były najlepszym kandydatem na ich materiał rusztowaniowy. Polimery te były nie tylko biokompatybilne, stabilne i elastyczne, ale również mogły być degradowane na drodze hydrolizy do produktów w postaci dwutlenku węgla i wody, a szybkość resorpcji polimeru można było zaprojektować tak, aby zmieniała się w skali czasowej od miesięcy do lat w zależności od stosunku wykorzystanych monomerów polimeru (1).
Kroki ku rzeczywistości
Lata następujące po sparowaniu Vacanti-Langer w 1985 roku charakteryzowały się szybkimi eksperymentami i rozwojem w dziedzinie inżynierii tkankowej w celu wyjaśnienia wykonalności przewidywanego rusztowania do regeneracji tkanek.
Jeden z pierwszych przeprowadzonych eksperymentów wykorzystywał mały krążek z polibezwodnika, w którym hepatocyty zostały zasiane w monowarstwie na płytce i wszczepione zwierzęciu (patrz Rycina 3). Analiza wykazała, że liczba i gęstość komórek nie były wystarczające do udanego wszczepienia (1). Jednakże, eksperyment ten doprowadził do uświadomienia sobie fundamentalnego ograniczenia. Wszystkie komórki wymagają odpowiedniej wymiany tlenu i substancji odżywczych ze środowiskiem oraz usuwania produktów odpadowych. Ponieważ przenoszenie masy zachodzi tylko na powierzchni zewnątrzkomórkowej, stosunkowo łatwo jest to osiągnąć dla pojedynczej warstwy komórek. Wraz ze wzrostem masy komórek zwiększa się powierzchnia wymiany – podobnie jak masa komórek, które tej wymiany wymagają. Tak więc przy opracowywaniu kształtów rusztowań należy wziąć pod uwagę te względy, aby umożliwić odpowiednie pozyskiwanie składników odżywczych i przeżycie (2). Jak Joseph Vacanti tak elokwentnie opisał ten problem, „…można równie dobrze spróbować wyhodować roślinę domową wewnątrz piłki do koszykówki (3).” W poszukiwaniu odpowiedzi na ten fundamentalny problem, Vacanti twierdzi, że pomysł przyszedł mu do głowy, kiedy obserwował wodorosty na brzegu Cape Cod podczas rodzinnych wakacji. Pod skórą wodorostów kryje się rozgałęziona sieć pustych w środku gałęzi, które spełniają wymagania dotyczące stosunku objętości do powierzchni i dostarczają organizmowi świeżego tlenu, jednocześnie pozbywając się produktów ubocznych w postaci odpadów. Ten projekt wodorostów z rozgałęzioną siecią zainspirował użycie znacznie bardziej przewiewnych, „bawełniano-kulkowych” polimerów w przyszłych eksperymentach (2).
Kilka lat później, w 1991 r., nastąpił kolejny ważny przełom eksperymentalny pod kierownictwem dr Charlesa Vacanti w University of Massachusetts Medical School (1). Grupa ta była w stanie z powodzeniem stworzyć homogenne płytki chrząstki, z których każda ważyła do 100mg, używając syntetycznych, biodegradowalnych szablonów obciążonych chondrocytami. Rusztowania te zostały następnie wszczepione pod skórę atymicznych myszy i poddane analizie. Po resorpcji polimeru nowo powstałe chrząstki zachowały względny kształt i wymiary oryginalnych szablonów. Dodatkowo, w próbkach pobranych po 81 dniach zaobserwowano luki, a nie w tych pobranych po 49 dniach lub wcześniej. Wyniki te sugerują, że tkanka dojrzała z metalowej do dorosłej chrząstki. Na poparcie tego wniosku w młodszych próbkach zaobserwowano kolagen typu III, który jest charakterystyczny dla niedojrzałej chrząstki hialinowej ssaków, natomiast kolagen typu II, który jest charakterystyczny dla dojrzałej chrząstki ssaków, zaobserwowano w próbkach implantowanych dłużej niż 49 dni (1). Dokonali tego Puelacher i wsp. w 1993 roku, opracowując modele ludzkiej chrząstki nosowej przy użyciu nietkanych siatek PGA, które zostały połączone 5% roztworem kwasu polimlekowego. Te polimerowe formy zostały zasiane zawiesiną chrondrocytów uzyskanych z chrząstki hialinowej noworodka wołowego. Kontrukty te wszczepiano następnie myszom atymicznym na okres 8 tygodni. Analiza wykazała, że rozmiar i kształt implantów został zachowany po resorpcji polimeru, pozostawiając stosunkowo sprężystą tkankę, która była w stanie przywrócić swoje pierwotne potwierdzenie po zgięciu (1).
Klasyczny eksperyment na myszach
Cel
Całkowita rekonstrukcja ucha jest bardzo trudnym zagadnieniem dla chirurgów plastycznych ze względu na złożoną strukturę ucha, a tkanka ma ograniczoną zdolność do regeneracji (2). Jednakże, istniałyby poważne korzyści kliniczne z posiadania ulepszonej metody regeneracji dla niemowląt, które rodzą się codziennie z niedorozwiniętymi uszami, a inne tracą te narządy w wyniku traumatycznych przeżyć (1). Obecnie istnieją dwie główne alternatywy dla całkowitej rekonstrukcji ucha zewnętrznego: implanty alloplastyczne i autogenne przeszczepy chrząstki. Implanty alloplastyczne są zazwyczaj wykonane z silikonu lub polipropylenu w gotowych formach. Jedną z zalet tej metody jest to, że materiały są dostępne w stosunkowo nieograniczonej ilości i nie wymagają dodatkowej pracy ani czasu, aby nadać im odpowiedni kształt, ponieważ są wstępnie uformowane. Jednak materiały te są bardzo podatne na infekcje i nie wykazują trwałości w długim okresie czasu. Z drugiej strony, wykorzystanie tkanek autogennych ma lepszą trwałość długoterminową, ale wiąże się z tym konieczność poświęcenia dużej ilości czasu na ukształtowanie rusztowania i często nie ma wystarczającej ilości chrząstki nadającej się do użytku (4).
W latach 90-tych Vacanti i Langer z powodzeniem wyhodowali ucho na grzbiecie atymicznej myszy, której nadali przydomek Auriculosaurus (3) (patrz rysunek_).
Nauka stojąca za tym
Konstrukcja urządzenia
Aby skonstruować rzeczywisty kształt i wymiary rusztowania, odlano ucho 3-letniego dziecka, używając alginianu jako materiału wyciskowego. Następnie z odcisku alginianowego wykonano odlew gipsowy, który posłużył jako forma do zaprojektowania konstrukcji z syntetycznego polimeru biodegradowalnego. Zastosowany polimer składał się z włókien kwasu poliglikolowego w postaci siatki o grubości ok. 100um i średnicy ok. 15um. Włókna siatki zostały następnie połączone po zanurzeniu w 1% roztworze kwasu polimlekowego na 2 sekundy. Po tym procesie, polimer został uformowany w kształt ucha przy użyciu formy gipsowej, a urządzenia zostały umieszczone w 35-mm polistyrenowych naczyniach do hodowli tkankowych (4).
Izolacja chondrocytów
Według Cao i wsp., chondrocyty zostały uzyskane ze „świeżo ubitych” przednich kończyn cieląt przy odbiorze z lokalnej rzeźni. Komórki zostały usunięte z powierzchni stawowych stawów i poddane trawieniu kolagenazą, wirowaniu, filtracji i różnym warunkom buforowania w celu przygotowania do procesu posiewu (4).
Wprowadzenie polimeru i implantacja do myszy atymicznych
W celu posiania polimerów zdysocjowanymi komórkami bydlęcymi, 3 ml zawiesiny chondrocytów składającej się z 1,5×10^8 komórek umieszczono na polimerach i pozwolono na inkubację przez 4 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza w celu promowania przyłączenia do włókien (patrz Rysunek_). Podłoże hodowlane zostało wzbogacone o 10% płodową surowicę kalifornijską, 5 ug/mL kwasu askorbinowego, 292 ug/mL L-glutaminy, 100 U/mL penicyliny i 100 ug/mL streptomycyny. Matryce inkubowano w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% CO2 przez 1 tydzień, a podłoże hodowlane wymieniano co 48 godzin (papier). Obrazy ze skaningowego mikroskopu elektronowego pokazują przyłączenie chrondrocytów do matrycy przed inkubacją, a także wykazują obecność składników macierzy zewnątrzkomórkowej wydzielanych przez komórki, co potwierdza ich zdolność do pełnienia zróżnicowanych funkcji.Po inkubacji, urządzenia zostały wszczepione podskórnie do athymicznych samców myszy w wieku 4-6 tygodni, przy zastosowaniu sterylnych procedur chirurgicznych i znieczulenia ogólnego (4).
Wyniki
Mimo, że eksperymentalna konfiguracja tej procedury była koncepcyjnie uproszczona, wyniki przyniosły bezcenny wgląd w ideę inżynierii tkanek do regeneracji za pomocą rusztowań 3D. Po 6 tygodniach inkubacji in vivo, grupa kontrolna nie wykazywała żadnych śladów tworzenia się chrząstki. Po usunięciu stentu skóra myszy zachowała swój pierwotny wygląd, a polimer uległ resorpcji zgodnie z oczekiwaniami. Jednak najbardziej znaczące wyniki dotyczyły różnic zaobserwowanych w grupach doświadczalnych I i II. Po 3-4 tygodniach inkubacji in vivo uwidoczniły się różnice w kształcie ucha. Okazy z grupy doświadczalnej I miały morfologię niemal identyczną z implantem, która była dobrze ugruntowana po 4 tygodniach i utrzymywała się przez dodatkowe 8 tygodni po usunięciu stentu (patrz Rysunek _). W przeciwieństwie do tego, u myszy z grupy eksperymentalnej II rozwinęło się ucho, które tylko w przybliżeniu odpowiadało temu z rusztowania polimerowego, ponieważ było zmniejszone w rozmiarze i zniekształcone w kształcie, co jest widoczne na Rycinie _ (4).
Odpowiedź społeczna
Ale dla społeczności naukowej i pionierów inżynierii tkankowej, ten przełom był monumentalny i ekscytujący otwierając liczne drogi do badań i podnosząc cenne pytania naukowe, miał on równie silną reakcję na społeczność naukową. Po opublikowaniu pracy Vacantiego w sierpniu 1997 roku, silny sprzeciw wyraziła grupa anty-genetyków i obrońców praw zwierząt. Tę nieprzychylną reakcję społeczną ułatwił film nakręcony przez BBC’s Tomorrow’s World, jak również reklama zamieszczona w New York Times przez grupę zwaną Turning Point Project (patrz rys. 6).
Reklama przedstawiała obraz myszy Vacantiego z wprowadzającym w błąd kapitanem, który stwierdził: „To jest rzeczywiste zdjęcie genetycznie zmodyfikowanej myszy z ludzkim uchem na plecach.” To stwierdzenie sugerowało, że naukowcy zmienili genom myszy poprzez wstawienie segmentów ludzkiego DNA. Silna reakcja wywołana przez grupy społeczne utrzymuje się do dziś, a niektóre z klasycznych podpisów pod artykułem są wymienione poniżej, aby pomóc w lepszym zrozumieniu, jak społeczność społeczna postrzegała te postępy naukowe (5):
„Czy ktoś myśli, że to szokujące, że ten nowopowstały przemysł biotechnologiczny czuje, że jest w porządku, aby uchwycić proces ewolucji i zmienić kształt życia na ziemi, aby pasował do jego bilansów?”
Jak dotąd nie istnieją żadne pół-ludzkie, pół-zwierzęce „chimery” (jak syreny czy centaury), ale wkrótce możemy je mieć”
„Firmy biotechnologiczne beztrosko usuwają komponenty istot ludzkich (i innych stworzeń) i traktują nas wszystkich jak części samochodowe na giełdzie.”
„Pewnego dnia, kiedy jedna z tych firm w końcu zdecyduje, że nastroje społeczne są przychylne, czy stworzy ludzko-goryla combo, który zajmie się ciężką pracą?”
„Czy straciliśmy rozum”? (5)
(1) Atala, Anthony, and David J. Mooney. Synthetic Biodegradable Polymer Scaffolds. Boston: Birkhäuser, 1997. Druk.
(5)Rouse, Roger.
(2) Vacanti, Joseph. „Inżynieria tkankowa i medycyna regeneracyjna.” Wykład. The Jayne Lecture. Amphilsoc. Web.
(3)D’Agnese, Joseph. „Brothers with Heart.” Discover July 2001. Discover Magazine. 1 lipca 2001. Web.
(4)Cao, Yilin, Joseph P. Vacanti, Keith T. Paige, Joseph Upton, and Charles A. Vacanti. „Transplantation of Chondrocytes Utilizing a Polymer-Cell Construct to Produce Tissue-Engineered Cartilage in the Shape of a Human Ear”. Plastic and Reconstructive Surgery 100.2 (1997): 297-302. Print.
(5)Rouse, Roger. „Who Plays God in the 21st Century?” New York Times 25 maja 2001, 9th ed., sec. 62. Print.