h3>9.5 Papel dos Nanobiosensores no Diagnóstico da TB
A bactéria tuberculosa é lenta no crescimento, levando 1-2 meses para o crescimento in vitro (Tortoli et al., 1997; Davies et al., 1999). Por conseguinte, é difícil encontrar a presença de infecção na sua fase inicial. A coloração Ziehl-Neelsen é o método convencional para a sua identificação. Esta coloração é necessária para a identificação preliminar do organismo causador, mas falta-lhe a sensibilidade (Moore e Curry, 1998; Mahaisavariya et al., 2005). Os métodos convencionais de cultivo de micobactérias são morosos e necessitam de várias semanas. A reacção em cadeia da polimerase (PCR) é um método sensível para a detecção precoce de micobactérias, mas o processo de amplificação requer um amplo tempo de processamento, químicos e reagentes, o que contribui para o elevado custo do ensaio. Além disso, é trabalhoso e caro (Tombelli et al., 2000; Minnuni et al., 2005). Portanto, há uma necessidade urgente de desenvolvimento de um método de diagnóstico rápido, de baixo custo e conveniente para a detecção da tuberculose. A este respeito, os biossensores parecem ser uma boa opção. Há uma procura crescente de tecnologia de biossensores para a detecção rápida e precisa da tuberculose com alta afinidade e especificidade. A tecnologia de biossensores tem o potencial de fornecer uma análise qualitativa e quantitativa e está livre de etiquetas radioactivas ou fluorescentes (Tombelli et al., 2000, Zhou et al., 2001; Yao et al., 2008).
Nos últimos anos, tendo em conta os benefícios de vários estudos notáveis realizados em nanotecnologia, foram feitos esforços importantes para a combinar com tecnologia de biossensores altamente sensíveis e precisos para desenvolver nanobiosensores. Os sistemas nanobiosensores são utilizados eficientemente no diagnóstico de doenças, monitorização ambiental, controlo de qualidade alimentar e defesa como uma abordagem inteligente (Zhou et al., 2011; Rai et al., 2012; Singh et al., 2014). Por exemplo, ao utilizar nanobiosensores revestidos a ouro, Duman et al. (2009) demonstraram a detecção muito eficaz de moléculas alvo (produtos sintéticos e PCR) a níveis nanomolares. Foi utilizado um oligodeoxinucleótido de cadeia única portador de um grupo de tiol no final e complementar da sequência característica alvo do complexo MTB como a sonda imobilizada na superfície revestida a ouro das lâminas de ressonância plasmónica de superfície. É interessante notar que a plataforma do sensor é reutilizável e tem uma longa duração de conservação. Um biosensor de microbalança de cristal de quartzo (QCM) em combinação com AuNPs foi desenvolvido para a detecção de MTB (Kaewphinit et al., 2012). Segundo o estudo, as AuNPs melhoraram a sensibilidade do eléctrodo de ouro imobilizado de cristal de quartzo utilizando a sonda específica de oligonucleótido modificado de tiol. O QCM demonstrou detectar até 5 pg de ADN genómico MTB sem mostrar qualquer hibridação cruzada com outras micobactérias.
Durante os últimos anos, muitas técnicas exploraram os materiais à escala nanométrica para a concepção de biosensores com elevada especificidade e eficácia. Entre todos os nanomateriais, os óxidos metálicos são de particular interesse devido às suas propriedades físicas, químicas e catalíticas únicas (Shi et al., 2014). Das et al. (2010) fizeram uma importante tentativa de diversificar a aplicação de tais óxidos metálicos na geração de nanobiosensores para a detecção de micobactérias. Depositaram óxido de zinco à escala nanométrica sobre a placa de vidro revestida de índio-óxido de estanho (ITO). A presença de filmes de ZnO nanoestruturados permitiu um aumento da área da superfície electro-activa para a carga de moléculas de ADN e para a detecção de ADN alvo genómico até 100 pM, o que permite a detecção directa de agentes patogénicos em amostras clínicas no ponto de tratamento. As principais características da técnica são: (i) a imobilização covalente do sensor sem utilizar qualquer reticulação que possa limitar a sua sensibilidade; (ii) limite de detecção de 0,065 ng/µL; (iii) o processo de detecção requer apenas 60 s; (iv) pode ser reutilizado até 10 vezes; e (v) estável até 4 meses a 4°C. Portanto, é um nanobiosensor eficiente para o diagnóstico rápido e preciso de micobactérias (Das et al., 2010). O óxido de zircónio (ZrO2) é um importante óxido de metal com maior estabilidade e inércia. Além disso, tem afinidade com grupos que contêm oxigénio. Das et al. (2011) desenvolveram o óxido de zircónio e nanotubos de carbono (NanoZrO2-CNT) nanocompostos à base de nanobiosensores de ácido nucleico depositados na ITO. O grupo utilizou este eléctrodo (NanoZrO2-CNT/ITO) para imobilização de ADN de sonda única (ssDNA) específica para MTB para revelar a sua aplicação ao biosensor para detecção de ácidos nucleicos.
Thiruppathiraja et al. (2011) fabricaram e avaliaram o biosensor electroquímico de ADN para ADN genómico de Mycobacterium sp. utilizando um amplificador de sinal como nanopartículas de ouro de dupla etiquetagem (AuNPs). O método envolve a estratégia de detecção em sanduíche compreendendo dois tipos de sondas de ADN: as sondas da enzima ALP e a sonda de detecção conjugada em AuNPs. Ambas estas sondas eram específicas para o ADN genómico de Mycobacterium sp. O estudo alegou que, em condições optimizadas, o limite de detecção do método era de 1,25 ng/mL de ADN genómico. Os referidos nanobiosensores eram também promissores e a avaliação das amostras clínicas da saliva mostrou a maior sensibilidade e especificidade. Outro estudo (Torres-Chavolla e Alocilja, 2011) com diferentes abordagens também fabricou o biossensor baseado no ADN, abrangendo AuNPs e partículas magnéticas terminadas por aminas (MPs) para detectar as micobactérias. O estudo utilizou a amplificação isotérmica dependente de hélicas termofílicas (tHDA) e AuNPs revestidas de dextrina como repórteres electroquímicos. As AuNPs e MPs foram funcionalizadas independentemente com diferentes sondas de ADN que hibridizam especificamente com um fragmento dentro de um gene de micobactérias. Mais tarde, esse grupo separou magneticamente o complexo MP-target-AuNPs da solução e detectou as AuNPs electrochemicamente. Torres-Chavolla e Alocilja (2011) afirmaram que a sensibilidade deste método era de 0,01 ng/μL de alvo isotermicamente amplificado de 105 bp. Tal sensor pode assim ser utilizado para analisar regularmente as amostras clínicas suspeitas de terem micobactérias.
Além das nanopartículas de óxido metálico, o silício poroso também está a receber mais atenção no que diz respeito a aplicações de biossensores, principalmente em aplicações sem rótulos. Wu et al. (2012) fizeram uso de um biosensor de microcavidade de silício poroso em nanoescala para o sero-diagnóstico rápido de MTB. Através de uma série de experiências, o estudo atestou a viabilidade deste biosensor para a detecção da interacção entre o antigénio 16 kDa e o anticorpo 16 kDa. A detecção de MDR-TB é da maior importância. Num estudo recente, Li et al. (2014) relataram o desenvolvimento de um sensor de ADN para a detecção específica do gene rpoB da MDR-TB, utilizando óxido de grafite complexo-funcionalizado de ruténio (II) como interface de detecção de suspensão e ADN de cadeia única marcada com ferroceno (FC-ssDNA) como controlador de intensidade de electroquímiluminescência (ECL). O ensaio baseia-se no princípio de que quando o alvo ssDNA mutante é hibridizado com FC-ssDNA, é libertado da superfície Ru-Go, levando à recuperação da ECL. O ensaio é relatado como tendo um intervalo de detecção de 0,1 a 100 nM e 0,04 nM sensibilidade.
Mais estudos são necessários que se concentram principalmente na fabricação de vários nanobiosensores para o diagnóstico de uma doença tão horrível. Como esta técnica é altamente sensível, requer pouca preparação de amostras e é rápida, específica, barata e fácil de usar; tem grande potencial para o diagnóstico clínico de TB.