Trova le fonti: “Sonda di ibridazione” – notizie – giornali – libri – scholar – JSTOR (dicembre 2009) (Impara come e quando rimuovere questo messaggio modello)
In biologia molecolare, una sonda di ibridazione è un frammento di DNA o RNA di lunghezza variabile (di solito 100-10000 basi lungo) che può essere radioattivamente o fluorescentemente marcato. Può quindi essere utilizzato in campioni di DNA o RNA per rilevare la presenza di sostanze nucleotidiche (il bersaglio RNA) che sono complementari alla sequenza nella sonda. La sonda si ibrida quindi all’acido nucleico a singolo filamento (DNA o RNA) la cui sequenza di basi permette l’accoppiamento sonda-base target grazie alla complementarità tra la sonda e il target. La sonda etichettata viene prima denaturata (per riscaldamento o in condizioni alcaline come l’esposizione all’idrossido di sodio) in DNA a singolo filamento (ssDNA) e poi ibridata all’ssDNA bersaglio (Southern blotting) o all’RNA (northern blotting) immobilizzato su una membrana o in situ.Per rilevare l’ibridazione della sonda alla sua sequenza bersaglio, la sonda viene marcata (o “etichettata”) con un marcatore molecolare di molecole radioattive o (più recentemente) fluorescenti; i marcatori comunemente usati sono il 32P (un isotopo radioattivo del fosforo incorporato nel legame fosfodiestere nel DNA della sonda) o la digossigenina, che è un marcatore non radioattivo, basato su anticorpi. Le sequenze di DNA o i trascritti di RNA che hanno una somiglianza di sequenza da moderata ad alta con la sonda vengono poi rilevati visualizzando la sonda ibridata tramite autoradiografia o altre tecniche di imaging. Normalmente, vengono scattate immagini a raggi X del filtro, oppure il filtro viene posto sotto la luce UV. Il rilevamento di sequenze con somiglianza moderata o alta dipende da quanto rigorose sono state applicate le condizioni di ibridazione – alta rigorosità, come l’alta temperatura di ibridazione e il basso sale nei buffer di ibridazione, permette solo l’ibridazione tra sequenze di acido nucleico che sono altamente simili, mentre bassa rigorosità, come la temperatura più bassa e l’alto sale, permette l’ibridazione quando le sequenze sono meno simili. Le sonde di ibridazione usate nei microarray di DNA si riferiscono al DNA covalentemente attaccato ad una superficie inerte, come i vetrini rivestiti o i chip genetici, a cui viene ibridato un cDNA target mobile.
A seconda del metodo, la sonda può essere sintetizzata usando il metodo della fosforamidite, o può essere generata ed etichettata tramite amplificazione PCR o clonazione (entrambi sono metodi più vecchi). Al fine di aumentare la stabilità in vivo della sonda RNA non viene utilizzato. Invece, possono essere usati analoghi dell’RNA, in particolare derivati del morfolino. Le sonde molecolari a base di DNA o RNA sono ora usate di routine nello screening di librerie di geni, nell’individuazione di sequenze nucleotidiche con metodi di blotting e in altre tecnologie genetiche, come i microarray di acidi nucleici e tessuti.