L’isolamento comportamentale è un meccanismo comune e potente di isolamento riproduttivo. Determinare la misura in cui l’isolamento comportamentale varia con le condizioni ambientali è fondamentale per comprendere la speciazione e il mantenimento dei confini delle specie. Qui, abbiamo testato l’effetto della salinità sull’isolamento comportamentale (riconoscimento della specie femminile, competizione maschio-maschio, e riconoscimento della specie maschile) tra due killifish strettamente correlati (Lucania goodei e L. parva) che differiscono nella tolleranza alla salinità. Abbiamo eseguito saggi senza scelta e prove comportamentali in cui i maschi potevano competere e corteggiare le femmine in acqua dolce (0 ppt) e salmastra (15 ppt). Abbiamo trovato alti livelli di isolamento comportamentale che non variavano in funzione della salinità. Nelle prove comportamentali, il riconoscimento delle specie maschili delle femmine era forte e asimmetrico tra le due specie. I maschi di Lucania goodei preferivano i conspecifici e raramente corteggiavano o si accoppiavano con le femmine di L. parva. I maschi di Lucania parva preferivano i conspecifici ma corteggiavano e si accoppiavano facilmente con le femmine di L. goodei. Questa asimmetria corrisponde alle asimmetrie precedentemente documentate nel fitness della prole ibrida. Gli incroci tra maschi di L. parva e femmine di L. goodei producono ibridi completamente vitali/fertili, ma gli incroci tra maschi di L. goodei e femmine di L. parva producono maschi con fertilità ridotta. Quindi, l’isolamento comportamentale può essersi evoluto in parte a causa del rinforzo.