9.5 Papel de los nanobiosensores en el diagnóstico de la tuberculosis
La bacteria de la tuberculosis es de crecimiento lento, tardando entre 1 y 2 meses en crecer in vitro (Tortoli et al., 1997; Davies et al., 1999). Por lo tanto, es difícil detectar la presencia de la infección en su fase inicial. La tinción de Ziehl-Neelsen es el método convencional para su identificación. Esta tinción es necesaria para la identificación preliminar del organismo causante, pero carece de sensibilidad (Moore y Curry, 1998; Mahaisavariya et al., 2005). Los métodos convencionales de cultivo de micobacterias requieren mucho tiempo y varias semanas. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es un método sensible para la detección temprana de micobacterias, pero el proceso de amplificación requiere mucho tiempo de procesamiento, productos químicos y reactivos, lo que contribuye al elevado coste del ensayo. Además, requiere mucha mano de obra y es caro (Tombelli et al., 2000; Minnuni et al., 2005). Por lo tanto, hay una necesidad urgente de desarrollar un método de diagnóstico rápido, de bajo costo y conveniente para la detección de la tuberculosis. En este sentido, los biosensores parecen ser una buena opción. Hay una creciente demanda de tecnología de biosensores para la detección rápida y precisa de la tuberculosis con alta afinidad y especificidad. La tecnología de biosensores tiene el potencial de proporcionar un análisis cualitativo y cuantitativo y está libre de etiquetas radiactivas o fluorescentes (Tombelli et al., 2000, Zhou et al., 2001; Yao et al., 2008).
En los últimos años, en vista de los beneficios de varios estudios notables realizados en nanotecnología, se han realizado importantes esfuerzos para combinarla con la tecnología de biosensores de alta sensibilidad y precisión para desarrollar nanobiosensores. Los sistemas de nanobiosensores se utilizan eficazmente en el diagnóstico de enfermedades, la vigilancia del medio ambiente, el control de la calidad de los alimentos y la defensa como enfoque inteligente (Zhou et al., 2011; Rai et al., 2012; Singh et al., 2014). Por ejemplo, mediante el uso de nanobiosensores recubiertos de oro, Duman et al. (2009) demostraron la detección de moléculas objetivo (productos sintéticos y de PCR) de forma muy eficaz a niveles nanomolares. Como sonda se utilizó un oligodeoxinucleótido monocatenario con un grupo tiol en el extremo y complementario de la secuencia característica de la diana del complejo MTB, inmovilizado en la superficie recubierta de oro de los portaobjetos de resonancia de plasmón superficial. Es interesante señalar que la plataforma del sensor es reutilizable y tiene una larga vida útil. Se ha desarrollado un biosensor de microbalanza de cristal de cuarzo (QCM) en combinación con AuNPs para la detección de MTB (Kaewphinit et al., 2012). Según el estudio, las AuNPs mejoraron la sensibilidad del electrodo de oro inmovilizado del cristal de cuarzo utilizando la sonda específica de oligonucleótidos modificados con tiol. El QCM ha demostrado detectar hasta 5 pg de ADN genómico de MTB sin mostrar ninguna hibridación cruzada con otras micobacterias.
Durante los últimos años, muchas técnicas han explotado los materiales a nivel de nanoescala para diseñar biosensores con alta especificidad y eficacia. Entre todos los nanomateriales, los óxidos metálicos son de especial interés debido a sus propiedades físicas, químicas y catalíticas únicas (Shi et al., 2014). Das et al. (2010) han hecho un importante intento de diversificar la aplicación de dichos óxidos metálicos en la generación de nanobiosensores para la detección de micobacterias. Depositaron óxido de zinc a nanoescala en una placa de vidrio recubierta de óxido de indio y estaño (ITO). La presencia de películas nanoestructuradas de ZnO permitió aumentar la superficie electroactiva para la carga de moléculas de ADN y para la detección de ADN genómico diana hasta 100 pM, lo que permite la detección directa de patógenos en muestras clínicas en el punto de atención. Las principales características de la técnica son (i) la inmovilización covalente del sensor sin utilizar ningún reticulante que pueda limitar su sensibilidad; (ii) límite de detección de 0,065 ng/µL; (iii) el proceso de detección requiere sólo 60 s; (iv) puede reutilizarse hasta 10 veces; y (v) es estable hasta 4 meses a 4°C. Por lo tanto, es un nanobiosensor eficiente para el diagnóstico rápido y preciso de las micobacterias (Das et al., 2010). El óxido de circonio (ZrO2) es un importante óxido de metal con mayor estabilidad e inercia. Además, tiene afinidad hacia los grupos que contienen oxígeno. Das et al. (2011) desarrollaron nanocompuestos de óxido de circonio y nanotubos de carbono (NanoZrO2-CNT) basados en nanobiosensores de ácidos nucleicos depositados sobre ITO. El grupo utilizó este electrodo (NanoZrO2-CNT/ITO) para la inmovilización de ADN sonda monocatenario (ssDNA) específico para MTB para revelar su aplicación al biosensor para la detección de ácidos nucleicos.
Tiruppathiraja et al. (2011) fabricaron y evaluaron el biosensor electroquímico de ADN genómico de Mycobacterium sp. utilizando un amplificador de señal como nanopartículas de oro (AuNPs) de doble etiquetado. El método consiste en una estrategia de detección tipo sándwich que comprende dos tipos de sondas de ADN: las sondas de la enzima ALP y la sonda detectora conjugada en AuNPs. Ambas sondas eran específicas para el ADN genómico de Mycobacterium sp. El estudio afirmaba que, en condiciones optimizadas, el límite de detección del método era de 1,25 ng/mL de ADN genómico. Dichos nanobiosensores también eran prometedores y la evaluación de las muestras de esputo clínico mostraba la mayor sensibilidad y especificidad. Otro estudio (Torres-Chavolla y Alocilja, 2011) con diferentes enfoques también fabricó el biosensor basado en el ADN que abarca AuNPs y partículas magnéticas terminadas en amina (MPs) para detectar las micobacterias. El estudio utilizó la amplificación isotérmica dependiente de la helicasa (tHDA) y las AuNP recubiertas de dextrina como reporteros electroquímicos. Las AuNPs y los MPs fueron funcionalizados independientemente con diferentes sondas de ADN que hibridan específicamente con un fragmento dentro de un gen de micobacterias. Posteriormente, ese grupo separó magnéticamente el complejo MP-objetivo-AuNPs de la solución y detectó electroquímicamente las AuNPs. Torres-Chavolla y Alocilja (2011) afirmaron que la sensibilidad de este método era de 0,01 ng/μL de diana amplificada isotérmicamente de 105 pb. Por lo tanto, dicho sensor puede utilizarse para analizar regularmente las muestras clínicas sospechosas de tener micobacterias.
Además de las nanopartículas de óxido metálico, el silicio poroso también está recibiendo más atención en lo que respecta a las aplicaciones de biosensores, sobre todo en aplicaciones sin etiquetas. Wu et al. (2012) utilizaron un biosensor de microcavidades de silicio poroso a nanoescala para el serodiagnóstico rápido de MTB. A través de una serie de experimentos, el estudio demostró la viabilidad de este biosensor para la detección de la interacción entre el antígeno de 16 kDa y el anticuerpo de 16 kDa. La detección de la TB-MDR es de suma importancia. En un estudio reciente, Li et al. (2014) informaron del desarrollo de un sensor de ADN para la detección específica del gen rpoB de la MDR-TB mediante el uso de óxido de grafeno funcionalizado con complejo de rutenio (II) (Ru-GO) como interfaz de detección en suspensión y ADN monocatenario marcado con ferroceno (FC-ssDNA) como controlador de intensidad de electroquimioluminiscencia (ECL). El ensayo se basa en el principio de que cuando el objetivo de ssDNA mutante se hibrida con FC-ssDNA, se libera de la superficie del Ru-Go, lo que lleva a la recuperación de la ECL. Se ha informado de que el ensayo tiene un rango de detección de 0,1 a 100 nM y una sensibilidad de 0,04 nM.
Se necesitan más estudios que se centren principalmente en la fabricación de varios nanobiosensores para el diagnóstico de una enfermedad tan terrible. Debido a que esta técnica es altamente sensible, requiere poca preparación de la muestra y es rápida, específica, barata y fácil de usar; tiene un gran potencial para el diagnóstico clínico de la tuberculosis.