9.5 Role of Nanobiosensors in Diagnostics of TB
Bakteria gruźlicy jest powolna we wzroście, potrzebuje 1-2 miesięcy na wzrost in vitro (Tortoli et al., 1997; Davies et al., 1999). Dlatego też trudno jest stwierdzić obecność infekcji w jej wczesnym stadium. Konwencjonalną metodą identyfikacji jest barwienie metodą Ziehl-Neelsena. Barwienie to jest potrzebne do wstępnej identyfikacji organizmu sprawcy, ale nie jest wystarczająco czułe (Moore i Curry, 1998; Mahaisavariya i in., 2005). Konwencjonalne metody hodowli prątków są czasochłonne i wymagają kilku tygodni. Łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR) jest czułą metodą wczesnego wykrywania prątków, ale proces amplifikacji wymaga długiego czasu przetwarzania, substancji chemicznych i odczynników, co przyczynia się do wysokich kosztów badania. Ponadto, jest to metoda pracochłonna i kosztowna (Tombelli et al., 2000; Minnuni et al., 2005). Dlatego też istnieje pilna potrzeba opracowania szybkiej, taniej i wygodnej metody diagnostycznej do wykrywania gruźlicy. Pod tym względem biosensory wydają się być dobrym rozwiązaniem. Istnieje rosnące zapotrzebowanie na technologię biosensorową do szybkiego i precyzyjnego wykrywania gruźlicy z wysokim powinowactwem i specyficznością. Technologia biosensorowa może potencjalnie zapewnić analizę jakościową i ilościową i jest wolna od znaczników radioaktywnych lub fluorescencyjnych (Tombelli i in., 2000, Zhou i in., 2001; Yao i in., 2008).
W ostatnich latach, w związku z korzyściami płynącymi z różnych niezwykłych badań przeprowadzonych w nanotechnologii, podjęto istotne wysiłki w celu połączenia jej z wysoce czułą i dokładną technologią biosensorową w celu opracowania nanobiosensorów. Systemy nanobiosensorów są efektywnie wykorzystywane w diagnostyce chorób, monitorowaniu środowiska, kontroli jakości żywności i obronie jako inteligentne podejście (Zhou i in., 2011; Rai i in., 2012; Singh i in., 2014). Na przykład, wykorzystując nanobiosensory pokryte złotem, Duman i wsp. (2009) wykazali wykrywanie cząsteczek docelowych (produktów syntetycznych i produktów PCR) bardzo skutecznie na poziomie nanomolarnym. Jako sondę unieruchomioną na pokrytej złotem powierzchni szkiełek do powierzchniowego rezonansu plazmonowego wykorzystano jednoniciowy oligodezoksynukleotyd posiadający na końcu grupę tiolową i komplementarny do docelowej sekwencji charakterystycznej dla kompleksu MTB. Warto zauważyć, że platforma czujnika jest wielokrotnego użytku i ma długi okres przydatności do użycia. Biosensor z mikrobalansem kwarcowym (QCM) w połączeniu z AuNPs został opracowany do wykrywania MTB (Kaewphinit i in., 2012). Według badań, AuNPs poprawiły czułość unieruchomionej złotej elektrody kryształu kwarcowego przy użyciu specyficznej, modyfikowanej tiolem sondy oligonukleotydowej. Wykazano, że QCM może wykryć do 5 pg genomowego DNA MTB bez wykazywania hybrydyzacji krzyżowej z innymi prątkami.
W ciągu ostatnich kilku lat wiele technik wykorzystało materiały w skali nano do projektowania biosensorów o wysokiej specyficzności i skuteczności. Wśród wszystkich nanomateriałów szczególnym zainteresowaniem cieszą się tlenki metali, ze względu na ich unikalne właściwości fizyczne, chemiczne i katalityczne (Shi i in., 2014). Das i wsp. (2010) podjęli ważną próbę urozmaicenia zastosowania takich tlenków metali w generacji nanobiosensorów do wykrywania prątków gruźlicy. Osadzili oni nanoskalowy tlenek cynku na szklanej płytce pokrytej tlenkiem indu i cyny (ITO). Obecność nanostrukturalnych warstw ZnO pozwoliła na zwiększenie powierzchni elektroaktywnej do ładowania cząsteczek DNA i wykrywania docelowego genomowego DNA do 100 pM, co umożliwia bezpośrednie wykrywanie patogenów w próbkach klinicznych w miejscu opieki. Głównymi cechami tej techniki są: (i) kowalencyjne unieruchomienie czujnika bez użycia jakiegokolwiek cross-linkera, który mógłby ograniczyć jego czułość; (ii) granica wykrywalności 0,065 ng/µL; (iii) proces detekcji wymaga jedynie 60 s; (iv) może być ponownie użyty do 10 razy; oraz (v) stabilność do 4 miesięcy w temperaturze 4°C. Jest to zatem skuteczny nanosensor do szybkiej i dokładnej diagnostyki prątków gruźlicy (Das et al., 2010). Tlenek cyrkonu (ZrO2) jest ważnym tlenkiem metalu o większej stabilności i obojętności. Ponadto, ma on powinowactwo do grup zawierających tlen. Das et al. (2011) opracowali nanokompozyt tlenku cyrkonu i nanorurek węglowych (NanoZrO2-CNT) oparty na nanobiosensorach kwasu nukleinowego osadzonych na ITO. Grupa wykorzystała tę elektrodę (NanoZrO2-CNT/ITO) do immobilizacji jednoniciowego DNA sondy (ssDNA) specyficznego dla MTB, aby ujawnić jej zastosowanie w biosensorze do wykrywania kwasów nukleinowych.
Thiruppathiraja et al. (2011) wytworzyli i ocenili elektrochemiczny biosensor DNA dla genomowego DNA Mycobacterium sp. używając wzmacniacza sygnału w postaci podwójnie znakowanych nanocząstek złota (AuNPs). Metoda obejmuje strategię detekcji typu sandwich, w skład której wchodzą dwa rodzaje sond DNA: sondy enzymu ALP oraz sondy detektora sprzężone z AuNPs. Obie te sondy były specyficzne dla genomowego DNA Mycobacterium sp. W badaniach stwierdzono, że w zoptymalizowanych warunkach granica wykrywalności metody wynosiła 1,25 ng/mL genomowego DNA. Wspomniane nanosensory były również obiecujące, a ocena próbek plwociny klinicznej wykazała wyższą czułość i specyficzność. W innym badaniu (Torres-Chavolla i Alocilja, 2011), stosując różne podejścia, również wytworzono biosensor oparty na DNA, obejmujący AuNPs i cząstki magnetyczne zakończone aminami (MPs) do wykrywania prątków gruźlicy. W badaniach wykorzystano termofilną izotermiczną amplifikację zależną od helikazy (tHDA) oraz pokryte dekstryną AuNPs jako elektrochemiczne repetytory. AuNPs i MPs były niezależnie funkcjonalizowane różnymi sondami DNA, które specyficznie hybrydyzowały z fragmentem genu prątków gruźlicy. Następnie grupa ta oddzieliła magnetycznie kompleks MP-target-AuNPs od roztworu i wykryła AuNPs elektrochemicznie. Torres-Chavolla i Alocilja (2011) stwierdzili, że czułość tej metody wynosi 0,01 ng/μL izotermicznie amplifikowanego targetu o długości 105 bp. Taki czujnik może być zatem stosowany do regularnej analizy próbek klinicznych podejrzanych o obecność prątków gruźlicy.
Oprócz nanocząstek tlenków metali, porowaty krzem również zyskuje coraz więcej uwagi w zakresie zastosowań biosensorowych, głównie w aplikacjach bezetykietowych. Wu et al. (2012) wykorzystali nanoskalowy porowaty krzemowy biosensor mikro-wnękowy do szybkiej serodiagnozy MTB. Poprzez serię eksperymentów, badanie potwierdziło wykonalność tego biosensora do wykrywania interakcji pomiędzy antygenem 16 kDa i przeciwciałem 16 kDa. Wykrywanie MDR-TB jest niezwykle ważne. W najnowszym badaniu Li i wsp. (2014) donieśli o opracowaniu czujnika DNA do specyficznego wykrywania genu rpoB MDR-TB poprzez zastosowanie funkcjonalizowanego kompleksem rutenu (II) tlenku grafenu (Ru-GO) jako interfejsu wyczuwającego zawiesinę oraz znakowanego ferrocenem jednoniciowego DNA (FC-ssDNA) jako kontrolera intensywności elektrochemiluminescencji (ECL). Test opiera się na zasadzie, że kiedy zmutowane docelowe ssDNA hybrydyzuje z FC-ssDNA, jest uwalniane z powierzchni Ru-Go, co prowadzi do odzyskania ECL. Test ma zakres detekcji od 0.1 do 100 nM i czułość 0.04 nM.
Potrzebne są dalsze badania, które głównie skupią się na wytwarzaniu różnych nanosensorów do diagnozowania tak strasznej choroby. Ponieważ technika ta jest bardzo czuła, wymaga niewielkiego przygotowania próbki, jest szybka, specyficzna, tania i łatwa w użyciu, ma duży potencjał w klinicznej diagnostyce gruźlicy.