9.5 Ruolo dei nanobiosensori nella diagnostica della TB
Il batterio del tubercolo è lento nella crescita, impiegando 1-2 mesi per la crescita in vitro (Tortoli et al., 1997; Davies et al., 1999). Pertanto, è difficile trovare la presenza dell’infezione nella sua fase iniziale. La colorazione di Ziehl-Neelsen è il metodo convenzionale per la sua identificazione. Questa colorazione è necessaria per l’identificazione preliminare dell’organismo causale, ma manca di sensibilità (Moore e Curry, 1998; Mahaisavariya et al., 2005). I metodi convenzionali di coltivazione dei micobatteri sono lunghi e richiedono diverse settimane. La reazione a catena della polimerasi (PCR) è un metodo sensibile per il rilevamento precoce del micobatterio, ma il processo di amplificazione richiede molto tempo di lavorazione, prodotti chimici e reagenti, che contribuiscono all’alto costo del test. Inoltre, richiede molta manodopera ed è costoso (Tombelli et al., 2000; Minnuni et al., 2005). Pertanto, c’è un urgente requisito per lo sviluppo di un metodo diagnostico rapido, a basso costo e conveniente per il rilevamento della TBC. A questo proposito, i biosensori sembrano essere una buona opzione. C’è una crescente domanda di tecnologia dei biosensori per il rilevamento rapido e preciso della TBC con alta affinità e specificità. La tecnologia dei biosensori ha il potenziale per fornire un’analisi qualitativa e quantitativa ed è priva di tag radioattivi o fluorescenti (Tombelli et al., 2000, Zhou et al., 2001; Yao et al., 2008).
Negli ultimi anni, alla luce dei benefici di vari studi notevoli effettuati nel campo delle nanotecnologie, sono stati fatti importanti sforzi per combinarle con la tecnologia dei biosensori altamente sensibili e precisi per sviluppare nanobiosensori. I sistemi di nanobiosensori sono efficacemente utilizzati nella diagnosi delle malattie, nel monitoraggio ambientale, nel controllo della qualità degli alimenti e nella difesa come approccio intelligente (Zhou et al., 2011; Rai et al., 2012; Singh et al., 2014). Per esempio, utilizzando nanobiosensori rivestiti in oro, Duman et al. (2009) hanno dimostrato il rilevamento di molecole bersaglio (prodotti sintetici e PCR) in modo molto efficace a livelli nanomolari. Un oligodeossinucleotide a filamento singolo che porta un gruppo tiolo all’estremità e complementare alla sequenza caratteristica del target del complesso MTB è stato usato come sonda immobilizzata sulla superficie rivestita d’oro dei vetrini a risonanza plasmonica di superficie. È interessante notare che la piattaforma del sensore è riutilizzabile e ha una lunga durata di conservazione. Un biosensore con microbilancia a cristallo di quarzo (QCM) in combinazione con AuNPs è stato sviluppato per il rilevamento di MTB (Kaewphinit et al., 2012). Secondo lo studio, AuNPs ha migliorato la sensibilità dell’elettrodo d’oro immobilizzato del cristallo di quarzo utilizzando la sonda oligonucleotidica specifica tiolo-modificata. Il QCM ha dimostrato di rilevare fino a 5 pg di DNA genomico MTB senza mostrare alcuna ibridazione incrociata con altri micobatteri.
Negli ultimi anni, molte tecniche hanno sfruttato i materiali a livello di nano-scala per progettare biosensori con alta specificità ed efficacia. Tra tutti i nanomateriali, gli ossidi metallici sono di particolare interesse per le loro proprietà fisiche, chimiche e catalitiche uniche (Shi et al., 2014). Das et al. (2010) hanno fatto un importante tentativo di diversificare l’applicazione di tali ossidi metallici nella generazione di nanobiosensori per il rilevamento di micobatteri. Hanno depositato ossido di zinco in nanoscala sulla piastra di vetro rivestita di indio-stagno (ITO). La presenza di film di ZnO nanostrutturati ha permesso un aumento della superficie elettroattiva per il caricamento di molecole di DNA e per rilevare DNA genomico bersaglio fino a 100 pM, il che permette la rilevazione diretta di agenti patogeni in campioni clinici al punto di cura. Le caratteristiche principali della tecnica sono: (i) l’immobilizzazione covalente del sensore senza utilizzare alcun cross-linker che potrebbe limitare la sua sensibilità; (ii) limite di rilevamento di 0,065 ng/µL; (iii) il processo di rilevamento richiede solo 60 s; (iv) può essere riutilizzato fino a 10 volte; e (v) stabile fino a 4 mesi a 4°C. Pertanto, è un nanobiosensore efficiente per una diagnosi rapida e accurata dei micobatteri (Das et al., 2010). L’ossido di zirconio (ZrO2) è un importante ossido di metallo con maggiore stabilità e inerzia. Inoltre, ha affinità verso i gruppi contenenti ossigeno. Das et al. (2011) hanno sviluppato un nanocomposito di ossido di zirconio e nanotubi di carbonio (NanoZrO2-CNT) basato su nanobiosensori di acido nucleico depositati su ITO. Il gruppo ha utilizzato questo elettrodo (NanoZrO2-CNT/ITO) per l’immobilizzazione di DNA sonda a singolo filamento (ssDNA) specifico per MTB per rivelare la sua applicazione al biosensore per il rilevamento degli acidi nucleici.
Thiruppathiraja et al. (2011) hanno fabbricato e valutato il biosensore elettrochimico per il DNA genomico di Mycobacterium sp. utilizzando un amplificatore di segnale come nanoparticelle d’oro (AuNPs) con doppia etichetta. Il metodo prevede la strategia di rilevamento a sandwich che comprende due tipi di sonde di DNA: le sonde dell’enzima ALP e la sonda rivelatrice coniugata su AuNPs. Entrambe queste sonde erano specifiche per il DNA genomico di Mycobacterium sp. Lo studio ha affermato che in condizioni ottimizzate, il limite di rilevamento del metodo era di 1,25 ng/mL di DNA genomico. I suddetti nanobiosensori erano anche promettenti e la valutazione dei campioni di espettorato clinico ha mostrato una maggiore sensibilità e specificità. Un altro studio (Torres-Chavolla e Alocilja, 2011) con approcci diversi ha anche fabbricato il biosensore basato sul DNA che comprende AuNPs e particelle magnetiche (MPs) con terminale in ammina per rilevare i micobatteri. Lo studio ha fatto uso dell’amplificazione isotermica termofila elicasi-dipendente (tHDA) e delle AuNPs rivestite di destrina come reporter elettrochimici. Le AuNPs e MPs sono state funzionalizzate indipendentemente con diverse sonde di DNA che si ibridano specificamente con un frammento all’interno di un gene di micobatteri. Successivamente, quel gruppo ha separato il complesso MP-target-AuNPs magneticamente dalla soluzione e ha rilevato AuNPs elettrochimicamente. Torres-Chavolla e Alocilja (2011) hanno affermato che la sensibilità di questo metodo era di 0,01 ng/μL di target amplificato isotermicamente di 105 bp. Un tale sensore può quindi essere utilizzato per analizzare regolarmente i campioni clinici sospettati di avere micobatteri.
Oltre alle nanoparticelle di ossido di metallo, anche il silicio poroso sta ricevendo maggiore attenzione per quanto riguarda le applicazioni di biosensori, soprattutto in applicazioni senza etichetta. Wu et al. (2012) hanno fatto uso di un biosensore a micro-cavità di silicio poroso su scala nanometrica per la sierodiagnosi rapida della MTB. Attraverso una serie di esperimenti, lo studio ha testimoniato la fattibilità di questo biosensore per il rilevamento dell’interazione tra l’antigene 16 kDa e l’anticorpo 16 kDa. Il rilevamento della MDR-TB è di estrema importanza. In uno studio recente, Li et al. (2014) hanno riferito lo sviluppo di un sensore di DNA per il rilevamento specifico del gene rpoB di MDR-TB utilizzando l’ossido di grafema funzionalizzato con complesso di rutenio (II) (Ru-GO) come interfaccia di sospensione-sensing e DNA a filamento singolo marcato con ferrocene (FC-ssDNA) come regolatore di intensità di elettrochemiluminescenza (ECL). Il test si basa sul principio che quando il bersaglio ssDNA mutante si ibrida con FC-ssDNA, viene rilasciato dalla superficie Ru-Go, portando al recupero di ECL. Il saggio è segnalato per avere un range di rilevamento da 0,1 a 100 nM e una sensibilità di 0,04 nM.
Sono necessari altri studi che si concentrino principalmente sulla fabbricazione di vari nanobiosensori per la diagnosi di una malattia così terribile. Poiché questa tecnica è altamente sensibile, richiede poca preparazione del campione ed è veloce, specifica, economica e facile da usare, ha un grande potenziale per la diagnosi clinica della TBC.